[发明专利]稻飞虱翅中总RNA高效提取的方法

摘要

本发明公开了一种稻飞虱翅中总RNA高效提取的方法，与传统利用Trizol提取RNA相比具有以下优点：方法简单方便，只需要在步骤中加入冷冻贮存及石英砂助研磨，就能高效的提取出飞虱翅翼中总RNA，提取的翅中总RNA，不被外源或内源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的总RNA的纯度，以利于后续试验的利用；获得的翅中总RNA纯度高、完整度好，浓度满足多种实验需求，可用于反转录cDNA、PCR、qPCR等下游操作等分子生物学的操作应用，实用价值显著。

主权项

稻飞虱翅中总RNA高效提取的方法，其特征在于包括以下步骤：a)实验用具及耗材灭菌及RNA酶灭活处理：用0.1％DEPC水溶液浸泡实验器材和枪头24h以上，部分耗材利用灭菌锅高温高压湿热灭菌处理，玻璃棒及石英砂等利用干燥箱200℃干热灭菌处理2h以上；工作台面用RNA酶清除剂擦拭干净；解剖针置于无水乙醇中浸泡后用酒精灯进行灼烧灭活处理；b)稻飞虱翅的分离：将稻飞虱成虫利用无RNA酶水漂洗数次后，放入离心管中迅速置于液氮罐中数十秒，使其迅速死亡，用灭菌后的解剖针迅速解离出稻飞虱翅部，避免残留翅根部肌肉组织带入，装入已加入300μL Trizol试剂的离心管中，并放置在冰上，收集到长翅60头以上，短翅120头以上的稻飞虱翅翼后，将离心管置于‑40℃保存24h；c)总RNA的提取：c1)在室温下解冻步骤b得到的样品，待样品处于熔融状态时利用高温灭菌后的玻璃棒沿着管壁研磨翅翼，待研磨难以进行时加入200目规格0.01g石英砂助研磨，使翅脉中内容物充分释放，研磨完毕再加入700μL Trizol试剂，混匀静置2min；c2)加入200μL氯仿，剧烈振荡后室温静置；c3)将上述混合物离心后获得水相、蛋白相和氯仿相，取水相，加入与水相等体积的异丙醇溶液，轻轻颠倒混匀后室温下静置10min；c4)将步骤c3)中得到的混合物继续离心后弃掉液体，保留管底微量白色固体；c5)配制75％乙醇溶液：吸取无水乙醇750μL于一个新的无RNA酶离心管中，再加入0.1％DEPC处理水250μL，颠倒摇匀，放置冰上冷却；c6)将1mL 75％乙醇溶液加入步骤c4)得到的含有沉淀物的离心管中，剧烈振荡，使白色沉淀物悬浮在乙醇溶液中；c7)重复以上步骤c4)‑c6)，再进行两次洗涤；c8)小心弃掉离心管中上清液，用滤纸吸干离心管壁液体，将离心管放在超净工作台中通风吹干，加入20μL无RNA酶水，用Nanodrop核酸定量仪测定浓度，分装置于‑70℃超低温冰箱备用，同时利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。