[发明专利]一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法

摘要

本发明涉及一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法，包括以下步骤： 根据羊泰勒虫18S rRNA基因序列，找到基因保守序列靶基因位点，设计了特异性引物序列I，根据羊无浆体16S rRNA基因序列，找到基因保守序列为靶基因位点，设计了特异性引物序列II；将特异性引物序列I的上、下游引物和特异性引物序列II的上、下游引物及PCR混合液加入PCR反应管中，混合后加入待测血液样品中提取出来的羊泰勒虫DNA及羊无浆体DNA；将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；取PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳。该法以具有快速、特异、灵敏、高效、低成本等特点，便于临床应用。

主权项

一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重PCR方法，其特征在于包括以下步骤：（1）引物设计 根据GenBank登录号：AF081136.1、KJ188221.1、AY260172.1、AF081137.1、U97052.1，用DNAMAN软件比对羊泰勒虫18S rRNA基因序列，找到基因保守序列靶基因位点，设计了特异性引物序列I为：上游引物Tf：5' ATTCCCGCATCCTATTTAGCAG 3'和下游引物Tr：5' CGACTCCTTCAGCACCTT 3'；    根据GenBank登录号：JQ917906.1、AY149637.1、JF514513.1、AF311303.1，用DNAMAN软件比对羊无浆体16S rRNA基因序列，找到基因保守序列为靶基因位点，设计了特异性引物序列II：上游引物Af：5' ACACGGTCCAGACTCCTACG3'和下游引物Ar：5'AGGTACCGTCATTATCTTCCCTACT3'；（2） 羊泰勒虫DNA及羊无浆体DNA的提取：使用血液基因组DNA提取试剂盒按照说明书提取待测血液样品DNA；（3） 以设计的特异性引物序列I的上、下游引物和特异性引物序列II的上、下游引物为引物，以Theileria spp和Anaplasma spp阳性样品及阴性对照为模板，PCR混合液加入PCR扩增管中，进行双重PCR反应条件优化及双重PCR特异性试验、敏感性试验及重复性试验；（4） 将PCR管置于PCR扩增仪中进行循环；（5） 取PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳。