[发明专利]基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法

摘要

本发明公开了一种基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，首先进行农杆菌菌液培养，再选取不同成熟期的果实进行农杆菌注射，分别在注射后第三天、第五天、第七天将注射后的果实摘下，进行gus组织染色检测，最后检测gus基因表达量。本发明方法能够使基因在番茄果实中短时间内得到表达，比传统的转基因方法更快速，更便捷；因为本方法采用的是活体注射的方法，以往常规方法均不能够从根本上改变基因的表达量，也不能够在果实的生长发育过程中通过对某些基因的干扰或者超标达观察果实发育状况，本发明方法不仅仅简化了操作过程，而且能够通过对果实发育中一些基因表达量的改变来观察到番茄果实成熟发育中的变化，能够更加清楚的了解番茄果实成熟发育收那些基因的控制。

主权项

1.一种基于农杆菌注射法的番茄果实基因转化方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)农杆菌菌液培养将农杆菌菌液在YEB固体培养基上划线后挑取单菌落在YEB液体培养基中摇菌培养，YEB液体培养基中添加卡那霉素25～50mg/L和利福平50～100mg/L，在28℃的条件下，180～200rmp振荡培养约12～16小时至OD600为0.4～0.8，将50mL菌液在离心机中5000rmp离心后倒去上清液，收集菌体沉淀，将收集的沉淀用MS液体培养基悬浮液重悬，重悬后测定OD600在0.4，将重悬后的菌液放于0～4℃的冷藏环境下备用；所述农杆菌菌液选用根癌农杆菌C58、AGL0和EHA105；(2)农杆菌注射步骤(2)将番茄果实按照不同的发育时期分为五个不同的时期，其中前两个时期为番茄果实绿果期，第一个时期为果实刚刚形成，果实直径大约3～5毫米，为小绿果；第二个时期为果实发育一段时间后果实直径大约5～8毫米，为大绿果；第三个时期为番茄果实开始从绿果向白果转化，果实变白，为白果期；第四个时期是番茄果实由白变黄，为黄果期，直至果实完全变为黄色；第五个时期为红果期，果实完全为红色；选取不同成熟期的果实进行注射，注射农杆菌悬浮液至果实中，从果柄处注入菌液，每次注射20微升，每天注射一次，一共连续注射三天；(3)gus组织染色检测分别在注射后第三天、第五天、第七天将注射后的果实摘下，用刀片切成1～2毫米的薄片，放入gus染色液中，进行染色鉴定，染色过夜后用70％酒精去除叶绿素后统计转化效率，转化效率以gus染色率来表示，在染色后的果实薄片中，以蓝色占果面50％以上为准统计出具有gus基因瞬时表达的数量也就是gus染色率：gus染色率＝(染色的果实数量/总注射果实数)×100％；(4)gus基因表达量检测取注射后第五天果实，提取果实RNA，反转录为cDNA后进行荧光定量PCR，检测gus基因表达量。