[发明专利]利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法

摘要

利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，涉及基因工程和蛋白质工程。1)工程菌构建；2)工程菌发酵：将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发酵培养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体。3)纯化。应用SUMO表达系统高效稳定、可溶性地表达SUMO-bFGF融合蛋白，在SUMO肽段N端前设计组氨酸标签，融合蛋白可以特异结合Ni-NTA resin，经过同样含有组氨酸标签的SUMO蛋白酶ULP1切割后可以获得无任何氨基酸残基残留的高纯度的bFGF蛋白。经SDS-PAGE分析，诱导表达量高达28％，最终得到的bFGF蛋白纯度达到97％。

主权项

利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于包括以下步骤：1)工程菌构建：bFGF的原始基因序列如SEQ ID NO.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2，原始基因序列中存在Ncol酶切位点，故将其第6位的C突变成A，其氨基酸序列仍保持不变，全序列合成优化后的基因序列如SEQ ID NO.3；SUMO蛋白酶ULP1在SUMO C端Gly‑Gly后酶切，使用overlap PCR将SEQ ID NO.3序列与SUMO DNA序列拼接，并在拼接序列两端设计Ncol和Xhol酶切位点，拼接序列内部并无这两内切酶酶切位点，最终得到的序列为SEQ ID NO.4；使用Ncol和Xhol酶切拼接序列与质粒pRSFD连接；设计引物如下：Part A：模板：p SUMOUp primer for pSUMO‑Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCAbFGF Down primer for A:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTCPart B:模板：bFGF genebFGF Up Primer for B:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTAbFGF Down primer for B‑Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA将构建好的质粒pRSFD‑SUMO‑bFGF转化至感受态细胞E.Coli BL21(DE3)中；2)工程菌发酵：将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发酵培养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体；3)纯化：裂解菌体，离心收集上清液，SUMO蛋白N端前段有His‑Tag，可以被Ni胶亲和吸附，将上清液与Ni胶混合使之结合到Ni胶上，加入SUMO蛋白酶ULP1酶切，bFGF用砂芯漏斗过滤；收集的bFGF溶液中还有少量杂质，使用Heparin柱亲和吸附bFGF，冲洗杂质后，用缓冲液洗脱，纯化后的bFGF溶液进行冻干，即得到bFGF蛋白冻干粉。