[发明专利]测定人TERT基因rs2735940位点多态性的方法及试剂盒

摘要

测定人TERT基因rs2735940位点多态性的方法及试剂盒。该方法，包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人TERT基因rs2735940位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有错配碱基C；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含CYGG或CCYGG片段的扩增产物，其中Y为人TERT基因rs2735940位点上的待定碱基C或T；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人TERT基因rs2735940位点上的待定碱基Y是C还是T。限制性内切酶为能够切开CCGG片段与CTGG片段之一的限制性内切酶,或能够切开CCCGG片段与CCTGG片段之一的限制性内切酶。本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。

主权项

1.一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人TERT基因rs2735940位点多态性的方法，包括：提供待测人基因组DNA；提供扩增人TERT基因rs2735940位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游引物具有错配碱基C；以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含CCYGG片段的扩增产物，其中Y为人TERT基因rs2735940位点上的待定碱基C或T；提供限制性内切酶；利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切以获得相应的酶切产物；以及根据所得酶切产物来确定人TERT基因rs2735940位点上的待定碱基Y是C还是T，其中，限制性内切酶为能够切开CCCGG片段与CCTGG片段之一的限制性内切酶，通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增产物的总片段长度在100至300bp之间，并且下游引物的片段长度为40～60bp，使得酶切切掉部分片段占总片段的长度的百分比超过20％，其中所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长度的未切断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产物，通过判断酶切产物所包含的片段类型来确定人TERT基因rs2735940位点上的待定碱基Y是C还是T，其中判断酶切产物所包含的片段类型是通过凝胶电泳联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的，其中参照图是扩增产物在凝胶电泳标准设定时间后经紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图像位置，其中第一参照图像位置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图像位置则针对的是切断后具有较长片段的扩增产物，其中酶切反应后将酶切产物浓缩1～2倍浓度后再进行电泳，其中控制PCR扩增程序中退火温度的范围在60～69℃之间，并控制PCR扩增程序中延伸时间的范围在15～30s之间，其中PCR溶液中Mg2+浓度在1.5～2.0mmol/L之间，并且PCR反应引物的终浓度为0.1～1μM左右，其中PCR反应中还加入助溶剂二甲亚砜和硫酸铵，其中上游引物为:5'ATTGTGTTTT CTATGTTGGC TTCTC 3'(SEQ ID NO:2),下游引物为:5'ACGCTCGCTG GAGGTTAGCC TCGTCTTGTA AATACTTAGG ATTCC 3'(SEQ ID NO:3)。