[发明专利]诱导多能干细胞体外定向分化成晶状体小体的方法

摘要

本发明涉及新型诱导多能干细胞体外定向分化成晶状体小体的方法。目的是提供的方法应能形成形态良好且具备光学功能的晶状体小体；获得的晶状体小体可用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。技术方案是：新型诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：(1)将多能干细胞定向诱导分化成初级神经外胚层细胞团；(2)分离挑选初级神经外胚层细胞团；(3)诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体；(4)诱导初级晶状体小体分化为成熟的晶状体小体。所述方法获得的晶状体小体，用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。

主权项

1.一种诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：（1）将多能干细胞定向诱导分化成初级神经外胚层细胞团将多能干细胞接种到基质胶溶液包被的六孔板上，用含人生长因子noggin的mTesR培养液培养5‑7天后形成初级神经外胚层细胞团；所述基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成, 胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8‑1.2%；（2）分离挑选初级神经外胚层细胞团用乙二胺四乙酸溶液消化初级神经外胚层细胞团，然后用机械法将初级神经外胚层细胞团周边的数层神经外胚层细胞挑出；（3）诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体将挑出的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶溶液包被的六孔板中，用含人生长因子bFGF、BMP4、BMP7的mTesR培养液培养5‑7天并且每日更换培养液，保留出现“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其余细胞团剔除，继续培养8‑10天后即可获得初级晶状体小体；所述新的基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8‑1.2%；（4）诱导初级晶状体小体分化为成熟的晶状体小体用含人生长因子bFGF、Wnt3a的mTesR培养液培养初级晶状体小体，并且每日更换mTesR培养液，9‑11天后即可获得由囊膜、晶状体上皮细胞、晶状体初级纤维细胞及晶状体成熟纤维细胞构成的晶状体小体；所述步骤（1）中，mTesR培养液中含有90‑110ng/ml的人生长因子noggin；所述步骤（2）中挑出的神经外胚层细胞团为5‑10层的内层细胞、3‑7层的中层细胞以及3‑7层的外层细胞；所述步骤（3）“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其结构为外层数十层分化的上皮样细胞，细胞体积较中央区细胞明显增大，胞质多，细胞排列相对疏松，中央区细胞体积小排列紧凑，胞质少，两类细胞相接形成类似荷包蛋的结构；该“荷包蛋样” 的中央区细胞团较厚、周边为相连的裙边状。