[发明专利]一种检测3D类器官中P-gp介导的Rh123转运的方法及应用

摘要

本发明涉及一种检测3D类器官中p‑糖蛋白(P‑glycoprotein,P‑gp)介导的罗丹明123(Rh123)转运的方法及其在筛选P‑gp的抑制剂中的应用。首先对C57BL/6小鼠的小肠隐窝进行分选，接种到含有基质胶的培养皿中，并在Advanced DMEM/F12培养基中培养，形成3D类器官。然后利用该3D类器官模型定性定量检测P‑gp介导的Rh123的转运及P‑gp的抑制剂维拉帕米(Verapamil)对Rh123转运的影响，具体包括3D类器官分别与①P‑gp的底物Rh123②Rh123和Verapamil共孵育，使用超声破碎法释放3D类器官中的Rh123，最后在多功能酶标仪上对Rh123的浓度进行检测。该方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，可结合3D类器官模型开展P‑gp介导的药物转运的研究，也可进行P‑gp抑制剂体外筛选的研究。

主权项

1.一种检测3D类器官中P‐gp介导的Rh123转运的方法，所述方法包括以下步骤：(1)3D类器官与Rh123共孵育；(2)3D类器官的收集，利用超声破碎法释放其中的Rh123；(3)使用多功能酶标仪对Rh123的荧光强度进行检测；其中，步骤(1)中，所述3D类器官与含有所述Rh123的培养基进行共孵育，其中给药组同时含有Rh123和Verapamil，其中所述Rh123的浓度为10μM，所述Verapamil的浓度为20μM；步骤(1)中，在培养3D类器官后，进一步包括对3D类器官模型验证的步骤，包括(i)3D类器官形态的观察；(ii)mRNA水平上证明3D类器官中P‐gp的表达的量；(iii)免疫组织化学法确证P‐gp在3D类器官中表达的位置，其中，步骤步骤(ii)中，包括mRNA的提取；以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA；mdr1a引物的设计与验证；PCR扩增mdr1a基因；其中，所述mdr1a的引物序列为：上游引物‐F:CATTGCGATAGCAGGAGT；下游引物‐R:CTGGGTGAAGGAGAACGT；所述步骤(2)中，超声破碎法的具体操作条件为：在400瓦特(W)的工作电压下，超声时间为5秒(s)，间隙时间为2s，工作次数为3次；所述步骤(3)中，还包括将每个孔的计算所得浓度与3D类器官的个数进行相除，换算成单个3D类器官中的Rh123浓度。