[发明专利]一种焦测序定量检测甲基化的方法

摘要

本发明公开了一种焦测序定量检测甲基化的方法。该方法将基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后的PCR产物按照特定两核苷酸快速通过DNA模板序列中“A”、“G”、“T”区域，而dGTP加入测定DNA模板序列中“C”含量方式进行焦测序，连续记录每个测序反应得到信息：即得到两核苷酸合成数目的编码和dGTP合成数目信息，通过设定已确定的目标区域序列中所有GC位点中碱基C均不同程度的转化成T，再利用dGTP合成数目信息，实现目标区域序列中各甲基化位点的定量分析。本发明能够大幅度提高测序长度，拓宽了传统焦测序的分析范围，适合单样本PCR产物、以及混合样本PCR产物序列的甲基化定量分析。

主权项

1.一种非诊断为目的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：步骤包括：1）DNA提取；2）亚硫酸氢盐处理；3）PCR扩增；4）测序；5）关联分析；所述步骤4）的测序方法为：按照特定两核苷酸、dGTP加入方式进行焦测序；其中，两核苷酸测定序列反应得到合成数目的编码信息，dGTP测定序列反应得到合成数目信息；所述步骤4）的具体方法包括以下步骤：4-1）制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0.05-0.2 M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA链清除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板；4-2）测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80°C下放置5-10 min，自然冷却至室温，完成杂交；4-3）测序：配备测序反应体系，与所述步骤4-2）得到的杂交产物混合，焦测序反按照特定两核苷酸、dGTP加入方式进行；所述步骤4-2）中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的序列；所述步骤4）中，两核苷酸每个测序反应获得两核苷酸合成测序的信号强度信息，dGTP每个测序反应获得单个核苷酸合成测序的信号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强度均可以转化为核苷酸合成的数目；所述步骤5）中，根据焦测序得到的dGTP每个测序反应获得的核苷酸合成的数目信息，该数目信息是包为0≤xi≤1；所述关联分析为：假定一个GC位点中C被甲基化的程度为xi，其中0≤xi≤1，那么，在经过亚硫酸氢盐处理的PCR产物这个碱基序列中，含有“C”的DNA模板序列含量为xi，而含有由这个碱基未被甲基化转化而来的“T”DNA模板序列含量则为(1-xi)；根据dGTP测序反应得到的核苷酸合成的数目信息，即可求出xi的数值；所述特定两核苷酸是依据DNA模板分析片段确定的，包括(dCTP+dTTP)、(dATPαS+dCTP)、(dATPαS+dTTP)。