[发明专利]一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法

摘要

本发明公开了一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，将基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后的PCR产物进行两核苷酸合成焦测序，连续记录每个测序反应得到包括两核苷酸种类及其核苷酸合成数目的测序编码信息。通过设定已确定的目标区域序列中所有CG位点中碱基C均不同程度的转化成T，再利用两核苷酸合成焦测序得到的信息，进行关联分析，实现目标区域序列中甲基化的定量分析。本发明能够大幅度提高测序长度，拓宽了传统焦测序的分析范围，适合单样本PCR产物、以及混合样本PCR产物序列的甲基化分析。

主权项

1.一种非诊断为目的两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：其步骤包括：1）DNA提取；2）亚硫酸氢盐处理；3）PCR扩增；4）测序；5）关联分析；所述步骤4）的测序方法为：每个测序反应同时加入两种不同的核苷酸，得到由连续单个测序信息构成的一组测序编码信息；所述步骤4）的具体方法包括以下步骤：4-1）制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0.05-0.2 M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA链清除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板；4-2）测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80°C下放置5-10 min，自然冷却至室温，完成杂交；4-3）测序：配备测序反应体系，与所述步骤4-2）得到的杂交产物混合，单个测序反应选择两核苷酸组合为 (dATPαS+dCTP)、(dATPαS+ dTTP)、(dGTP+dTTP)、(dCTP+ dGTP)、(dCTP+dTTP)之一进行；连续测序反应选择不同的两组两核苷酸组合循环进行，或者根据分析的目标序列优化两核苷酸加入的顺序进行；所述步骤4-2）中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的一段序列；所述步骤4）中，每个测序反应获得的测序信息包括两核苷酸种类信息和测序信号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强度均能够转化为核苷酸合成的数目；所述步骤5）中，根据两核苷酸合成焦测序得到的一组测序反应获得编码信息，测序信号强度信息是包含零的正整数，或者是正非整数；所述步骤5）的具体步骤为：假定DNA分析片段内所有GC位点碱基“C”全被甲基化，得到一条100%被甲基化的DNA模板1序列，并转化成相应两核苷酸合成焦测序的最大一阶的整数编码信息；同时，假定DNA分析片段内所有GC位点碱基“C”全未被甲基化，得到一条100%未被甲基化的DNA模板2序列，并转化成相应两核苷酸合成焦测序的最大一阶的整数编码信息；所述关联分析为：假定一个GC位点中C被甲基化的程度为xi，其中0≤xi≤1，那么，在经过亚硫酸氢盐处理的PCR产物这个碱基序列中，含有“C”的DNA模板序列含量为xi，而含有由这个碱基未被甲基化转化而来的“T”DNA模板序列含量则为(1-xi)；某个实际测序反应得到的信号强度即核苷酸合成数目等于DNA模板1序列和DNA模板2序列合成测序贡献之和，并由此构建出相应的方程式或方程组，求出x i值，确定该位点的甲基化程度；当i=1，DNA模板1序列含量为x1， DNA模板2序列含量为(1-x1)；当i=2，该“C”碱基之前的DNA模板1序列含量为x1，该“C”碱基及其之后的DNA模板1序列含量为x2；由该“C”碱基转化成“T”碱基之前的DNA模板2序列含量为(1-x1)，由该“C”碱基转化成“T”碱基及其之后的DNA模板2序列含量为(1-x2)；依次类推，当i=i，该“C”碱基之前的DNA模板1序列含量为xi-1，该“C”碱基及其之后的DNA模板1序列含量为xi；由该“C”碱基转化成“T”碱基之前的DNA模板2序列含量为(1-xi-1)，由该“C”碱基转化成“T”碱基及其之后的DNA模板2序列含量为(1-xi)；将整个PCR产物测序信息上甲基化完成关联分析。