[发明专利]一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒及其应用。采用的技术方案是：动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒原代培养肝脏细胞、DMEM完全培养基、底物缓冲液、NAD+溶液和2,4‑二硝基苯肼溶液构成，该试剂盒可用于分析药物对肝脏细胞的损伤。本发明能提供一种有效分离原代肝脏细胞的方法及用作药物分析的试剂盒，原代分离培养肝脏细胞易贴壁，复苏后培养肝脏细胞状态佳，试剂盒测量效果良好，可作为判断药物对肝细胞损伤的依据之一。本发明可广泛应用于肝脏生理功能探索，细胞病理学、药理和毒理学机制的研究，以及新型药物肝细胞毒性检测。

主权项

1.一种筛选治疗肝脏疾病的药物的方法，其特征在于方法如下：1）将原代培养肝脏细胞，于DMEM完全培养基中，细胞贴壁24h后，换液时，实验组，加入含有待测药物的DMEM完全培养基，继续培养48h；对照组，加入不加药物的DMEM完全培养基，继续培养48h；2）实验组与对照组收集细胞，分别离心取上清液；3）取实验组与对照组离心后上清液，分别加入底物缓冲液，37℃水浴加热5min；所述的底物缓冲液是：pH为8.8的0.3mol/L的乳酸锂水溶液；4）实验组加入氧化型辅酶Ⅰ溶液，对照组加入双蒸水，37℃水浴加热15min；5）实验组与对照组，均加入2,4-二硝基苯肼溶液，37℃水浴加热15min；6）实验组与对照组，均加入NaOH溶液，混匀，室温放置5min，于440nm处测量吸光度值；所述的原代培养肝脏细胞的制备方法是：1）将动物肝脏组织放入平皿，采用灌流法，控制蠕动泵流速为0.9-1.7 mL/min ，灌入D-Hanks缓冲液冲洗血细胞，然后以同样流速灌流消化液10-20 min；所述的消化液是：0.08g/ L Ⅳ型胶原酶水溶液；2）将冲洗后的肝脏组织转移到新的平皿中，用细胞刷轻轻将细胞刮下，加入磷酸盐缓冲液，重悬细胞，过200目筛网，300 r/ min 离心4 min，弃上清液；3）加入4℃预冷的DMEM完全培养基重悬沉淀，300 r/ min 离心4 min，弃上清液，再次重悬沉淀，500 r/ min 离心4 min，弃上清液，得原代培养肝脏细胞。