[发明专利]一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法

摘要

本发明涉及致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法，有效解决现有检测方法费时、繁琐、特异性差的问题，取小鼠腹水和醋酸盐缓冲液，加入正辛酸，混匀，离心，上清液调pH值，加入硫酸铵，离心，沉淀物用PBS溶液溶解，透析，成单克隆抗体；用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，成悬液状的活化乳胶颗粒；将待标记抗体透析，加入单克隆抗体，滴加入活化乳胶颗粒中，用NaH2PO4漂洗，沉淀悬浮于牛血清白蛋白的缓冲液中，用玻璃纤维吸附标记物并干燥，取抗鼠IgG抗体固化到纤维膜上形成质控区，本发明将免疫反应的特异性、层析方法的快速性及彩色乳胶颗粒作为示踪物的直观性等优点结合在一起，简便、特异、灵敏。

主权项

一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条的制备方法，其特征在于，该测试条为，基材PVC板（1）上依次固定有引水玻璃纤维（3）、载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2）和吸水棉浆板（5），所述的硝酸纤维膜（2）上包被有检测区（8）和质控区（9），所述的引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖有第一覆膜（7），所述的吸水棉浆板（5）上覆盖有第二覆膜（6），由以下方法实现：1）制备纯化的单克隆抗体：取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18‑25℃室温放置25‑35分钟，4℃下15000转/分钟离心15‑25分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18‑25℃室温搅拌25‑35分钟，15000转/分 、4 ℃离心15‑25分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH 7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH 7.2的PBS缓冲液中，4℃透析45‑50小时，每9‑10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；所述的小鼠腹水制备方法是，将液体石蜡注射于Balb/c小鼠腹腔内，注射量为300‑500μl/只小鼠，10天后，分别将分泌抗Ｏ:3血清型、抗Ｏ:9血清型、抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×106/只小鼠，小鼠腹部隆起后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗Ｏ:3血清型、抗Ｏ:9血清型、抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的小鼠腹水；2）制备活化乳胶颗粒：用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH2PO4溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH2PO4溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取240‑260μl碳化二亚胺溶液加入到1200‑1300 μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；3）制备标记物：不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0 的NaH2PO4透析0.5‑1.5h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入20~200μg单克隆抗体，将透析的待标记抗体滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH2PO4漂洗1‑3次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用载体玻璃纤维吸附标记物并干燥；4）包被硝酸纤维膜： 取抗鼠IgG抗体以划线的方式固化到硝酸纤维膜上形成质控区（9）；抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体按体积1:1:1比例混合，以划线的方式固化到硝酸纤维膜上形成检测区（8）；检测区和质控区的包被划线相距5mm，抗鼠IgG抗体包被浓度为0.5 ~5mg/ml，抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的包被浓度分别为0.05~2mg/ml；5）测试条组装：取基材PVC板（1），将引水玻璃纤维（3）、含有乳胶颗粒标记单克隆抗体的载体玻璃纤维（4）、硝酸纤维膜（2），吸水棉浆板（5）固定粘贴于基材PVC板（1）上，所述的硝酸纤维膜（2）上包被有抗鼠IgG抗体的质控区（9）和抗Ｏ:3血清型、Ｏ:9血清型、Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性单克隆抗体的检测区（8），检测区（8）和质控区（9）暴露在覆膜外形成检测窗，引水玻璃纤维（3）和载体玻璃纤维（4）上覆盖有第一覆膜（7），吸水棉浆板（5）上覆盖有第二覆膜（6），切割成长条即可。