[发明专利]基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法

摘要

本发明涉及一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，所述的联合分析法包括：定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度；454 GS‑FLX Titanium测序分析鱼类物种组成比例；测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种；使用sufer 8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。本发明基于环境DNA鉴定技术，不依赖于鱼类物种的捕获，只需要采集水体样品即可对物种的有无和多少进行分析，采样方法简单，且可以最大限度的保护鱼类资源；同时，对于一些分布较少难以捕获的物种，该方法也较传统捕捞调查更为有效，本方法能够有效的解决样品中存在多种近缘物种条件下难以得到有效的物种特异性引物的问题，且只需要上述两种技术各进行一次实验，即了解所有物种的DNA丰度信息。 1

主权项

1.一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的联合分析法包括步骤：(1)样品DNA采集；(2)定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度，具体包括步骤：(2.1)通用引物的设计所述的通用引物选择在16s rRNA基因区域进行通用引物和探针设计，所设置的16s rRNA基因正向引物序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；16s rRNA基因反向引物序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；16s rRNA基因探针序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；(2.2)在设计好的通用引物下构建DNA标准品；(2.3)制作标准曲线，具体步骤包括：扩增包含检测目的的鱼类线粒体16s rDNA基因部分序列，进行PCR反应，反应产物经电泳检测后，采用TIANgel Midi Purification Kit，对PCR产物进行回收纯化；将所述的PCR产物连接到pMD19‑T载体上，转化入感受态细胞中，挑选菌斑进行培养，提取质粒后进行限制性内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳；DNA胶回收后进行浓度测定，在A260/A280大于1.8的情形下，按下述公式计算质粒拷贝数：拷贝数＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)/(648×质粒总长度)(g/mol)；质粒总长度＝2692bp+PCR产物长度；其中，6.02×1023是阿佛加德罗常数；648是每个碱基的平均分子量；使用EASY Dilution将构建的DNA标准品分别按照1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL梯度稀释作为模板进行Real Time PCR反应，制作DNA标准曲线，每种浓度标准质粒设3个重复，并做无模板对照；对构建的DNA标准品进行扩增反应，反应采用两步法：95℃30s预变性；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸21s，45个循环，反应结束后得到各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线；(2.4)实施定量PCR检测环境DNA的总鱼类DNA丰度将待测试的各环境DNA样本在标准品条件下进行反应，反应后带入标准曲线以获得各环境样点的DNA相对丰度拷贝数；(3)454GS‑FLX Titanium测序分析鱼类物种组成比例；(4)454测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种计算公式为：目标物种线粒体基因拷贝数＝实时定量PCR定量的鱼类总线粒体基因拷贝数×二代454测序获得的目标物种线粒体序列的百分比；(5)环境中鱼类线粒体DNA相对分布的分布图绘制使用sufer 8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。