[发明专利]一种油菜根系细胞质膜纯化和鉴定的方法及其应用

摘要

本发明属于植物生物化学技术领域。具体涉及一种油菜根系质膜纯化和鉴定的方法及其应用。以甘蓝型油菜根系鲜样为材料，利用构建的两相分配体系获取高纯度的甘蓝型油菜根系质膜。所述的两相分配体系由以下成分构成：6.2％的葡聚糖、6.2％的聚乙二醇、0.33M的蔗糖、3mM KCl和5mM的磷酸钾缓冲液(pH7.8)组成。本发明建立的两相反应体系可以用于所有油菜根系质膜的提取，所述的应用包括在正常条件、生物或非生物逆境条件下所得油菜根系高纯度质膜的提取，其所提取的高纯度质膜通过相关技术的膜蛋白鉴定，可用于油菜根系生长发育、根系响应生物和非生物逆境胁迫的膜蛋白质组学研究中。

主权项

一种油菜根系细胞质膜纯化和鉴定的方法，其特征在于，通过包括以下步骤获得高纯度细胞质膜的纯化方法和对所得的高纯度细胞质膜的鉴定方法，具体步骤如下：(1)建立两相分配体系：所述的两相分配体系由质量浓度6.2％的葡聚糖、质量浓度6.2％的聚乙二醇、0.33M的蔗糖、3mM的KCl以及pH 7.8的5mM磷酸钾缓冲液组成；(2)油菜根系细胞质膜的纯化在4℃以下的室温环境中或在冰上进行：1)取50g甘蓝型油菜根系鲜样，将根系鲜样与缓冲液I按1:4的质量比例混合，缓冲液I在使用前在4℃或在冰上充分预冷；在4℃以下的室温环境中用高速组织匀浆器研磨成匀浆，用孔径为210μm的四层尼龙布过滤，将所得滤液加入2mL的0.1M苯甲基磺酰氟溶液混匀后，用高速冷冻离心机在10,000g下离心15min，所得上清液再经超高速冷冻离心机在100,000g下离心30min，将离心后的沉淀重悬于9mL的缓冲液II中得到微粒体重悬液；取9g所得的微粒体重悬液加入到27g缓冲液III中充分混匀，形成一个36g的两相分配体系管2；2)分别用9g的缓冲液II替换微粒体重悬液与27g缓冲液III充分混匀，形成一个36g的体系用于制备新的上相管1及下相管3；3)将管2用水平转头在1,500g下离心5min促进分层，使细胞质膜分配到上层聚乙二醇相中，得到如管5所述的上相U1，将其它膜组分分配到下层葡聚糖相管5下相L1中；同时将管1和管3用水平转头在1,500g下离心5min，分别获管4和管6；4)将管5的上相U1与管4下相L2混匀后，用水平转头在1,500g下离心5min，获得上相管8上相U2′，将其与管7下相L3混匀后，再用水平转头在1,500g下离心5min获得管10上相U，即为含质膜的组分；5)将管5下相L1与管6上相U3混匀后，用水平转头在1,500g下离心5min，然后将获得的上相即管9上相U3′与管8下相L2′混匀后，用水平转头在1,500g下离心5min，获得管11上相U4，将其与管10下相L3′混匀后再用水平转头在1,500g下离心5min，获得管12上相U′；6)将获得的上相U与U′混合并用缓冲液IV稀释4倍后，用100,000g的超高速冷冻离心机离心30min，沉淀物即为纯化的质膜组分；7)将所得的纯化质膜组分重悬于100μL缓冲液V中，保存于‑80℃备用；(3)油菜根系细胞质膜的纯度鉴定:1)反应总体积为500μL，包含50mM pH 6.5的MES‑Tris缓冲液、3mM的三磷酸腺苷、5mM的MgSO₄、酶抑制剂和10μg质膜蛋白；以未加酶抑制剂的反应作对照，加入质膜蛋白后启动反应，在30℃水浴中反应20min后加入1mL的缓冲液VII终止反应；在25℃室温下放置30min后，在紫外分光光度计上于750nm波长下测定反应液的吸光值；反应中的酶抑制剂分别以0.1mM的正钒酸钠、50mM的硝酸钾、5mM的叠氮化钠溶液作为细胞质膜、液泡膜和线粒体膜的ATPase酶的特异抑制剂，以0.1mM的钼酸钠溶液作为非特异的磷酸酶抑制剂；2)分别取0，5，10，15，20，30μL的10mM的KH₂PO₄溶液于不同的离心管中，每一离心管中加50mM pH 6.5的缓冲液VI至500μL，在30℃水浴中反应20min后分别加入1mL的缓冲液VII终止反应，在室温下放置30min后，利用紫外分光光度计在750nm波长下分别测定其吸光值，根据浓度值与吸光值获得回归方程y＝48.912x‑0.557，方程中x为750nm下的吸光值，y为无机磷的浓度；3)将加入了质膜蛋白的各反应的吸光值代入回归方程计算出生成的无机磷含量，进而计算ATPase酶活性，酶活单位为nmol Pi min^‑1μg^‑1蛋白，继而计算加入酶抑制剂后的ATPase的相对酶活性：ATPase相对酶活性的计算公式为：其中上述步骤中应用的缓冲液按以下方法配制：①缓冲液I：0.4M蔗糖，75mM 3‑吗啉丙磺酸,5mM乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸,5mM四乙酸二氨基乙烷,10mM氟化钠,5mM二硫苏糖醇,5mM抗坏血酸，0.2％水解酪蛋白，1％聚乙烯吡咯烷酮，10％甘油，用KOH调pH至7.5；②缓冲液II：0.33M蔗糖，5mM pH 7.8磷酸钾缓冲液；③缓冲液III：20％葡聚糖11.16g，40％聚乙二醇5.58g，0.2M pH 7.8的磷酸钾缓冲液675μL，蔗糖3.05g，2M的KCl 54μL，加入超纯水至总重量为27g；④缓冲液IV：取20mM三羟甲基氨基甲烷溶液，加入HCl调节pH至7.5；⑤缓冲液V：0.25M蔗糖，20mM pH 7.5的Tris‑HCl；⑥缓冲液VI：取50mM2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸溶液，加入Tris调节pH至6.5；⑦缓冲液VII：1％十二烷基硫酸钠，1％钼酸铵，0.5％抗坏血酸和4％硫酸。