[发明专利]一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法

摘要

本发明提供了一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法,提出“单叶内生真菌分布”概念，“尺度限制性沙磨”和“约束性散接培养”两种技术方法，以期完善艾纳香植物叶片内生真菌对植物叶片的生理生化和代谢产物产生怎样影响的研究，改善和解决现有方法中存在的某些菌种丢失的缺陷和培养过程中真菌生长相互干扰等问题。本发明提供的艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法,操作简单快捷,试验材料简单易得，成本较低。

主权项

一种艾纳香植物叶片内生真菌的分离方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)艾纳香植物叶片组织的准备：采集、保存艾纳香植物健康叶片；(2)艾纳香植物叶片组织的表面消毒和无菌检测：将新鲜的艾纳香植物叶片样品用流动清洁水冲洗干净，放入超净工作台内；然后无菌水冲洗2‑3次，用75％的酒精消毒2‑3min；再用无菌水冲洗2‑3次，0.1％的升汞浸泡2‑3min，最后用无菌水冲洗3次；将最后一次冲洗用的无菌水，分别汲取3次，按每次0.5mL平铺在3个PDA培养基上，置于恒温培养箱内，28℃黑暗条件下培养7天，无任何菌株生长；(3)艾纳香植物叶片组织内生真菌的分离：在无菌条件下，剪去叶柄，再将叶片剪成小片，放入研钵，混入灭菌细沙，加入无菌水，共同研磨至粘稠状，得到植物组织、灭菌细沙和无菌水的混合物；用接种针挑取混合物至培养基接种后，置于恒温培养箱中培养3‑10天，进一步纯化，得到内生真菌纯菌株；前述步骤(3)中研磨使用“尺度限制性沙磨”技术：所用叶片大小为0.5×0.5cm²，灭菌细沙颗粒大小为通过100目筛同时200目筛截留的细沙，叶片、细沙和无菌水的比例为1:3:2，混合物采用人力手工研磨；前述步骤(3)中真菌培养使用“约束性散接培养”技术：挑取植物组织、细沙和水混合物体积0.5×0.5×0.2cm³；接种面积1cm²；混合物在约束面积内均匀铺开。