[发明专利]一种质粒DNA规模化纯化方法

摘要

本发明提供了一种质粒DNA规模化纯化方法，该方法采用三步纯化，第一步通过加入氯化钙使细菌基因组DNA和RNA以及大部分杂蛋白凝集后，通过纱网和囊式滤器过滤去除大块杂质，然后通过较大孔径的澄清纯化滤膜过滤质粒DNA裂解液，除去裂解液中小的碎片以及基因组DNA；第二步通过较小孔径的浓缩纯化滤膜浓缩洗滤质粒DNA，达到除去质粒DNA裂解液中的小分子化学物质、杂蛋白，RNA等杂质以及实现浓缩质粒DNA等目的；第三步通过加入表面活性剂Triton X-114，去除内毒素，并再次洗滤去除杂蛋白及RNA的杂质。以上方法依托于中空纤维超滤膜澄清纯化系统对质粒DNA进行纯化和浓缩，工艺合理有效，极大的提高了质粒DNA的生产效率，降低了纯化成本。

主权项

一种质粒DNA规模化纯化方法，其特征在于包括以下步骤：1)将氯化钙加入质粒DNA的裂解液中，使终浓度为0.2～2mol/L，过夜沉淀后，用50～500目纱网过滤裂解液，然后再用10～100μm囊式滤器过滤裂解液；2)将步骤1)过滤后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵循环，而后经0.22～0.65μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；3)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第一洗滤液待用；4)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第二洗滤液待用；5)以1:2(v/v)的比例将无菌的0.01M PBS缓冲液加入进料罐中的截留液中，重悬，开启循环泵循环，收集透过液，得到第三洗滤液待用；6)将步骤2)所述透过液、步骤3)所述第一洗滤液、步骤4)所述第二洗滤液、步骤5)所述第三洗滤液混合均匀，得到混合液；7)将步骤6)得到的混合液注入浓缩系统的进料罐，开启循环泵循环，而后经100～500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA裂解液；8)以1:1(v/v)的比例将0.01M PBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA裂解液；9)以1:1(v/v)的比例将0.01M PBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA裂解液；10)以1:1(v/v)的比例将0.01M PBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵，循环一定时间，弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA裂解液浓缩液；11)在步骤10)得到的DNA裂解液浓缩液中加入终浓度0.5～2％(W/V)的Triton X‑114，涡旋振荡后置于冰浴中10～40min；12)将步骤11)处理后裂解液注入澄清纯化系统的进料罐中，开启循环泵循环，而后经0.1～0.45μm中空纤维微滤柱微滤，收集透过液待用；13)将步骤12)得到的透过液注入浓缩系统的进料罐，并注入4倍体积的0.01M PBS，开启循环泵循环，经100～500KD中空纤维超滤柱超滤，弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为初级质粒DNA纯化液；14)以2:1(v/v)的比例将0.01M PBS注入进料罐中的初级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去透过液，收集进料罐中剩余截留液，即为二级质粒DNA纯化液；15)以2:1(v/v)的比例将0.01M PBS注入进料罐中的二级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为三级质粒DNA纯化液；16)以2:1(v/v)的比例将0.01M PBS注入进料罐中的三级质粒DNA裂解液中，重悬，开启循环泵循环，而后弃去洗滤液，收集进料罐中剩余截留液，即为质粒DNA纯化液；17)将步骤16)得到质粒DNA纯化液，用0.22μm囊式滤器过滤除菌，得到纯化的质粒DNA成品。