[发明专利]一种大分子量透明质酸的提取纯化方法

摘要

本发明提供了一种大分子量透明质酸的提取纯化方法，它是从高原鼢鼠中提取纯化得到，该透明质酸的平均分子量为2.6×10⁶-3.1×10⁶Da。本方法提取的透明质酸属于高分子透明质酸，其较好的保水功能具有较高的经济价值。高原鼢鼠是青藏高原上一种严重破坏草地的动物，本方法能将有害生物转化为具有高市场价值的产品。

主权项

一种大分子量透明质酸的提取纯化方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：(1)粗提：取高原鼢鼠，去掉头颅、皮肤、胃肠、膀胱，剩余部分绞碎，即为原料；以液料比(3.5～4.5)∶1ml/g加入蒸馏水，再加入原料重量1.0～2.0％EDTA‑Na₂和10.0～12.0％NaCl，在组织捣碎机内以10000～120000r/min捣5～10min后，4000‑8000r/min离心10～15min，上述操作重复2～4次，合并各次离心上清液，静置1.5～2h，其中，组织捣碎机内温度控制在20～30℃；在上清液中加入乙醇使其乙醇终浓度达到70％～75％，静置至沉淀析出，于4000～8000r/min离心10～15min，沉淀为HA粗提物；(2)酶解：配制0.05～0.1mol/L的NaHCO₃水溶液和0.05～0.1mol/L的Na₂CO₃水溶液，以NaHCO₃水溶液∶Na₂CO₃水溶液＝8～9∶1v/v进行混合至混合酶解液pH＝8.3～9.1，即得碱性缓冲水溶液；取上述碱性缓冲水溶液加入HA提取物，再加胰蛋白酶，酶比活力为1∶250，加酶量为原料质量的0.4～0.8％，于31～39℃，120r/min搅拌5～25h，得酶解液；(3)除脂及非水溶性杂质：向酶解液中加入其体积10～50％的氯苯，并以800～1000r/min搅拌20～30min，再于4000～8000r/min离心10～15min，抽取上清液；向上清液中加氯化钠至0.1～0.2mol/L，搅拌溶解后加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得除脂及非水溶性杂质后的1次初级HA沉淀；(4)除多肽向1次初级HA沉淀中加入5.6g/L～11.2g/L NaCl水溶液∶0.5～0.6g/L Na₂HPO₄·12H₂O水溶液∶0.05～0.06g/L NaH₂PO₄·2H₂O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，其中，原料∶缓冲液＝1∶1g/ml；搅拌直至完全溶解，向溶液中加2～4倍95％乙醇，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得除多肽的2次初级HA沉淀；(5)除核酸及小分子多肽向2次初级HA沉淀中加入11.6g/L NaCl水溶液∶0.55g/L Na₂HPO₄·12H₂O水溶液∶0.06g/L NaH₂PO₄·2H₂O水溶液＝1∶1∶1v/v/v组成的缓冲液，搅拌直至完全溶解，向溶液中加原料质量6～10％的活性炭，再加入活性炭1～2倍质量的高岭土，以60‑80r/min搅拌15～30min，然后于4000～8000r/min离心10～15min，上清液经0.22μm的滤膜抽滤，收取滤液即为除核酸及小分子多肽后的HA初级水溶液；(6)透析将HA初级水溶液移入50000～100000Da的透析袋中，于去离子水中透析1～5h，原料∶去离子水＝1∶8～20g/ml，袋内保留液即为HA精制水溶液：向HA精制水溶液中加入氯化钠使保留液NaCl终浓度达到0.1～0.2mol/L，搅拌溶解，加乙醇使乙醇终浓度达到70％～75％，搅拌，静置0.5～1h，于4000～8000r/min离心10～15min，取固形物即得纯化了的HA沉淀；(7)干燥取HA沉淀，经冷冻干燥，即得透明质酸纯品。