[发明专利]一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种牛乳铁蛋白肽的制备方法及应用，该方法选取氨基酸编码序列NO.1为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列NO.2，并在苷酸编码序列NO.2设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的5’端分别引入限制性酶切位点 EcoR I和 Xho I，PCR扩增获得抗菌肽基因片段，分别构建重组表达载体，转化大肠杆菌后诱导表达，超声裂解菌体，SDS-PAGE凝胶电泳检测，融合蛋白GST-LfcinB成功表达，融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化后，经羟胺剪切缓冲液切割融合蛋白，释放抗菌肽。通过琼脂扩散法抑菌实验检测其对大肠杆菌和金色葡萄球菌都具有明显的抑菌活性。克服了牛乳铁蛋白肽分子量较小容易被蛋白酶水解，造成产量低。

主权项

一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于按下列步骤进行：a、抗菌肽LfcinB 基因的合成：根据牛乳铁蛋白肽的基因序列LfcinB，选取氨基酸编码序列NO.1：Ac‑FKCRR WQWRM KKLGA P‑NH 为目标蛋白，然后将氨基酸序列NO.1，转化成核苷酸编码序列 NO.2：上游 5’‑TCA AAT GCT GGC GTT GGC AGT GGC GTT GGA AGA AAT TGG GTG CTC CTT TTC‑3’下游 5’‑ GAA AGC ACG ACG CAC GCA AGT GAT AGA AGG AGC ACC CAA TTT CTT CCA‑3’，再将核苷酸编码序列 NO.2，设计并人工合成两条反相互补的寡核苷酸链上下游引物，在上下两条引物的 5’端分别引入限制性酶切位点 EcoR I 和 Xho I，即得上游引物：5’‑GATCCTTCA AAT GCT GGC GTT GGC AGT GGC GTT GGA AGA AAT TGG GTG CTC CTT TTCTAAC；下游引物：5’‑TCGAGTTAGAA AGC ACG ACG CAC GCA AGT GAT AGA AGG AGC ACC CAA TTT CTT CCATTGAAG，引入酶切位点后，氨基酸编码序列NO.1目标蛋白上游引入羟胺切割蛋白位点天冬酰胺—甘氨酸；PCR 扩增目的抗菌肽基因：PCR 反应体系：超纯水 40μL，10×PCR含Mg₂⁺缓冲液 5μL，2.5mmol/L dNTPs 1μL，上游引物  1.5μL，下游引物 1.5μL，Taq 酶 1μL，共计 50μL；反应程序为： 温度94℃保持5分钟后，温度94℃反应30秒，温度55℃反应30秒，温度72℃反应30秒，共进行30循环后，温度72℃保持10分钟；PCR扩增产物经PCR纯化试剂盒纯化后，温度‑20℃保存备用；b、抗菌肽LfcinB 基因重组载体的构建：将步骤a中PCR 产物与表达载体 pGEX‑4T‑1 用 EcoR I 和 Xho I 进行双酶切反应，反应体系为载体 pGEX‑4T‑1 42μL ，EcoR I 1.5μL ，Xho I 1.5μL，10 × Fast Digest 缓冲液5μL ，Total 50μL 分别混匀，温度37℃水浴 20min；连接产物转化到BL21大肠杆菌中，在含有抗生素氨苄青霉素的 LB 固体平板上挑选转化子，分别接种于含50μg/mL 氨苄青霉素的 4mL LB 液体培养基中，温度37℃，220rpm 振荡培养 8‑10h，提取质粒后，PCR鉴定，并命名为pGEX‑4T‑1LfcinB；    c、重组抗菌肽LfcinB 基因的诱导表达：重组菌pGEX‑4T‑1LfcinB 经终浓度为 1mmol/L 异丙基硫代半乳糖苷诱导后，经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，与阴性对照相比，重组菌有明显浓集的目的蛋白表达条带，检测目的蛋白，即得牛乳铁蛋白肽。