[发明专利]一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法

摘要

本发明公开了一种基于生物砖串联双酶制备L-叔亮氨酸的方法，包括如下步骤：(1)构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件；(2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的E.coli工程菌；(3)将上述E.coli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导表达，获得发酵液，冷冻离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤、配制成细胞液；(4)将上述细胞液、三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物L-叔亮氨酸。本发明的方法产品转化率高，手性选择性较好，反应条件温和，操作简单，昂贵的辅酶可再生，单细胞表达双酶节约成本。

主权项

一种基于生物砖串联双酶制备L‑叔亮氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)构建能够串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的串联生物砖元件，其中亮氨酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID 01所示，甲酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID 02所示；(2)将上述串联生物砖元件导入大肠杆菌，构建基于串联表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的E.coli工程菌；(3)将上述E.coli工程菌接种于含氯霉素的液体扩大培养基中进行培养及诱导表达，获得发酵液，冷冻离心获得细胞，用pH6.5～8.5的缓冲液重悬、洗涤、配制成终浓度为0.05～100g/L的细胞液；(4)将上述细胞液、三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和用于辅酶再生的辅助底物置于pH＝6.0～13的缓冲体系中震荡反应，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物L‑叔亮氨酸，三甲基丙酮酸、氨基供体、辅酶和辅助底物在上述缓冲体系中的终浓度分别为0.015～0.300mol/L、0.5～1.5mol/L、0.005～0.2m mol/L和0.5～1.5mol/L，上述辅酶为NAD⁺或NADH，上述反应的温度为20～45℃，反应的时间为20～120h，震荡速率为150～300rpm。