[发明专利]基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法

摘要

本发明公开了一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，将一抗固定在同一个玻璃基底上，通过抗原抗体的相互作用，分别固定目标物。同时，在磁纳米颗粒上修饰二抗和一级编码链，得到磁纳米探针。接着，利用二抗和抗原间的特异性结合作用，将磁纳米探针固定在基底上，形成三明治结构的免疫复合物。磁纳米探针上的一级条码链作为扩增单元触发多分枝的杂交链反应，生成带有多重分支的双链结构。该分支链即为二级编码链。最后，二级编码链与一种多分子标记的荧光探针结合，产生增强的荧光信号，通过清点荧光点的数目对目标物进行定量。该方法实现了细胞因子的多重、灵敏检测，两种目标物的检测限均为5fM。

主权项

一种基于双编码和单分子计数的细胞因子多重检测方法，其特征是：步骤如下：(1)首先将待测样品加入相应抗体包被的基底上，37℃孵育2h；(2)利用PBS‑T和PBS分别清洗后，加入磁纳米探针，37℃孵育2h后，形成三明治式的免疫复合物，除去未反应的磁纳米探针，所述磁纳米探针通过将二抗和寡核苷酸修饰到streptavidin‑MNBs上制得；(3)加入发夹结构混合物和HCR缓冲液，所述HCR缓冲液为50mM Na2HPO4，0.5M NaCl，pH6.8，37℃孵育4h，所述发夹结构与磁纳米探针上的寡核苷酸配对形成带有多条分支的长双链结构；(4)利用PBS‑T和PBS分别清洗后，加入荧光探针，37℃孵育4h，所述荧光探针是由四条单链DNA杂交产生的十字形结构，其一端是伸出的悬垂序列，另外三端都标记了荧光基团，所述悬垂序列与带有多条分支的长双链结构结合；(5)利用PBS‑T和PBS分别清洗，加入PBS，通过倒置显微镜数点进行计数。