[发明专利]一种人类肠道益生菌的优化分离方法

摘要

本发明提出了一种人类肠道益生菌的优化分离方法，包括以下步骤：步骤一，基础培养基的制备：制备粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基；步骤二：筛选：收集粪便标本并接种于所述粘蛋白液体培养基中，厌氧培养得到菌液，取菌液作为模板进行PCR实验，挑选PCR反应阳性管中的菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养出菌落，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养出菌落，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落，取哥伦比亚血平板上的菌落通过16sRNA通用引物进行PCR测序验证，分离出人类肠道益生菌。本发明的人类肠道益生菌的优化分离方法实用、简单、直观和便捷。

主权项

1.一种人类肠道益生菌的优化分离方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一，基础培养基的制备：制备粘蛋白液体培养基和粘蛋白固体培养基；步骤二：筛选：收集粪便标本并接种于所述粘蛋白液体培养基中厌氧培养得到菌液，取菌液作为模板进行PCR实验，挑选PCR反应阳性管中的菌液接种于粘蛋白固体培养基上厌氧培养出菌落，将粘蛋白固体培养基上的菌落接种于巧克力平板上厌氧培养出菌落，将巧克力平板上的菌落接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养出菌落，取哥伦比亚血平板上的菌落通过16S RNA通用引物进行PCR测序验证，分离出人类肠道益生菌；所述粘蛋白液体培养基的制备方法如下：试剂准备：酸性微量元素：FeCl2·4H2O 1.491g；H3BO4 0.06g；ZnCl2 0.068g；CuCl2·7H2O 0.1725g；MnCl2 0.0635g；CoCl2·6H2O 0.0119g；NiCl2·6H2O 0.0235g；HCl 4.18ml，蒸馏水定容到100ml；碱性微量元素：Na2SeO3 0.01729g；Na2MoO4·2H2O 0.0242g；NaOH 0.4g，蒸馏水定容到100ml；维生素液：生物素0.02g；Vit B3 0.21g；Vit B6 0.5g；Vit B2 0.1g；Vit B1 0.2g；Vit B12 0.25g；泛酸0.1g，蒸馏水定容到100ml；1液：CaCl2 1.1g；MgCl2 1.0g；酸性微量元素1ml；碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；2液：Na2HPO4 5.3g；NaCl 3g；KH2PO4 4g，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；3液：NaHCO3 2g；维生素液2ml，定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；4液：Na2S 2.5g,蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；取200ml无菌蒸馏水盛于高压过的广口瓶中，在超净工作台中加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30‑40ml，纯化后的粘蛋白溶液在A230处出现盐峰，吸光度为0.42，每加入一种液体后需摇匀，用电动移液器吸取5ml的液体分装于15ml的离心管中，盖紧管盖，4℃密封保存；所述粘蛋白固体培养基制备方法如下：试剂准备：酸性微量元素：FeCl2·4H2O 1.491g；H3BO4 0.06g；ZnCl2 0.068g；CuCl2·7H2O 0.1725g；MnCl2 0.0635g；CoCl2·6H2O 0.0119g；NiCl2·6H2O 0.0235g；HCl 4.18ml,蒸馏水定容到100ml；碱性微量元素：Na2SeO3 0.01729g；Na2MoO4·2H2O 0.0242g；NaOH 0.4g，蒸馏水定容到100ml；维生素液：生物素0.02g；Vit B3 0.21g；Vit B6 0.5g；Vit B2 0.1g；Vit B1 0.2g；Vit B12 0.25g；泛酸0.1g，蒸馏水定容到100ml；1液：CaCl2 1.1g；MgCl2 1.0g；酸性微量元素1ml；碱性微量元素1ml，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；2液：Na2HPO4 5.3g；NaCl 3g；KH2PO4 4g，蒸馏水定容到100ml，高压125℃30min，常温密封保存；3液：NaHCO3 2g；维生素液2ml，定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；4液：Na2S 2.5g,蒸馏水定容到100ml，0.22μm滤膜过滤，4℃密封保存；称取2g琼脂于200ml蒸馏水中，高压125℃30min后，立即在超净工作台中加入2ml的1液、2ml的2液、1ml的3液、2ml的4液及纯化后的粘蛋白溶液30‑40ml，纯化后的粘蛋白溶液在A230处出现盐峰，吸光度为0.42，每加入一种液体后需摇匀；倒入无菌平皿中，每个平皿20ml；待冷却凝固后置于无菌塑料袋内，4℃密封保存。