[发明专利]一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法

摘要

本发明涉及一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，属于分子生物学领域；该方法主要包括pLeptin‑IRES2‑EGFP1过量表达载体的构建、过量表达pLeptin‑IRES2‑EGFP1质粒的转染，筛选并获得过量表达Leptin基因的阳性细胞系，再利用体细胞核移植技术构建转Leptin基因的重构胚，将重构胚移植到代孕母猪体内继续发育后获得转Leptin基因的克隆仔猪，取转Leptin基因克隆猪组织做过量表达验证，后期再进行转Leptin克隆猪的病理学观察和鉴定。本发明实现了Leptin基因在猪上的过量表达，该方法操作性简单、可靠性高，具有较高的实用性，为人类研究与Leptin基因功能相关代谢疾病的分子机理提供了可靠的模型和重要的参考意义。

主权项

1.一种构建过量表达Leptin基因的克隆猪的方法，其特征在于，主要按照以下步骤进行：第一步、构建Leptin基因过量表达载体1) 用PCR 法扩增目的Leptin基因并对胶进行回收，并将Leptin片段连接到pMD18‑T载体上，得到重组质粒pMD18‑Leptin；2) 酶切pIRES2‑AcGFP1 载体和pMD18‑Leptin 载体，利用胶回收试剂盒对所需的片段大小进行回收，将Leptin 连接到pIRES2‑AcGFP1载体上，得到重组质粒pLeptin‑IRES2‑AcGFP1 ；3) 采用试剂盒法制备无内毒素的质粒DNA，用于细胞转染，并对pLeptin‑IRES2‑AcGFP1载体进行回收和纯化，‑20℃保存备用；第二步、猪胎儿成纤维细胞转染、筛选1) 利用组织消化法建立猪30日龄胎儿成纤维细胞系，冻存备用；2) 复苏冻存备用的胎儿成纤维细胞系，进行G418毒性敏感性检测，得到10天内使细胞全部死亡的最适浓度为500ng/ul ；3) 再次复苏细胞，待细胞汇合度达到80‑90％时收集细胞并计数，将细胞用电击缓冲液重悬，并加入30ug leptin 过量表达载体pLeptin‑IRES2‑AcGFP1，移入电击杯中进行转染；4) 电击完成后，将细胞悬液迅速转移到100mm 培养皿中进行培养，48h后收集细胞进行初步鉴定和极度稀释培养；5) 根据步骤2)中得到的最适浓度，在极度稀释培养3天后换液，开始用加有适当浓度为500ng/ul的G418的含有10％ FBS的DMEM完全培养基进行培养，每隔3天换一次液，10d后能得到牛津杯大小单克隆点；6) 在显微镜下用记号笔画出单克隆点的位置，胰酶消化法抠出单克隆点放入48孔板中进行培养，第二天换加有一半浓度G418的含有10％FBS 的DMEM 完全培养基进行培养，每天观察细胞生长状况，将长满的细胞进行详细编号并传代至另外一个48孔板，一份用于鉴定是否是阳性，一份用于扩大培养；7) 待用于鉴定的细胞长满后，用胶原酶消化法收集细胞，提取细胞基因组DNA，通过PCR 鉴定是否是阳性,对鉴定出来的阳性细胞系进行扩大培养和冻存备用；第三步、Leptin 细胞的核移植及胚胎移植1) 受体卵母细胞的培养a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；b、挑选直径为3‑6mm的卵泡从中抽取卵丘‑卵母细胞复合体，放入TCM‑199成熟培养液滴中，在5％CO2，38.5℃的培养箱中培养38‑42h；2) 构建过量表达Leptin 基因的重构胚a、取转入Leptin基因的成纤维细胞，用含有0.5％FBS的DMEM 培养48h, 使体细胞处于G0或G1期；b、卵丘‑卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0.1mg.mL‑1透明质酸去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5‑1h，在操作液中用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将转Leptin 基因的成纤维体细胞导入到去核的卵母细胞的卵间隙中；3) 电融合和电激活重构胚再将每批20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23 培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后进行电激活，重构胚移入含有2.2ug.mL‑1CB的培养液中后放入含有5％CO2、5％O2、38.5℃的三气培养箱中平衡2h；4) 重构胚的体外培养将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植；5) 将重构胚移植到自然发情的代孕母猪内继续发育，代孕母猪妊娠114天后获得转Leptin基因的克隆仔猪；第四步、转Leptin基因克隆仔猪的过量表达验证利用设计好的GFP引物和Leptin引物对转Leptin克隆仔猪的DNA 和RNA进行验证。