[发明专利]一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法

摘要

本发明公开了一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法，首先室内进行喷雾接种，在感病对照丽江新团黑谷发病的情况下，表现感病的品种作好分级记录并结束试验；表现抗病的品种重新育苗，然后进行室内离体叶段点液接种，表现感病的品种作好分级记录并结束试验；表现抗病的品种重新育苗，再进行点液接种，病情稳定后及时记录发病情况。这揉合三种接种方法的一套抗性筛选技术，既避免了单一接种方法的不足，又节约了人为和物力，最终能够真实地表现一份水稻品种的室内抗稻瘟病能力，试验结果可以为大田推广品种、品种抗性基因的挖掘等奠定稳定可靠的基础。

主权项

1.一种室内水稻品种稻瘟病抗性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采用孢子振落法分离稻瘟病菌单孢：先将穗颈瘟标本置于无菌水中浸泡48h，后移至培养皿中保湿培养48h使之产孢，培养皿中预先放有浸有无菌水的吸水纸，吸水纸一端作成纸枕，使标本两端接触吸水纸、病斑部分悬空，温度26℃，光：暗＝12h：12h；当病斑部分出现一层灰绿色细密孢子，用洗耳球将孢子轻轻吹落于事先准备好的清水琼脂培养基上，进行镜检，把视野中的单个孢子打好标记，挑取标记部位的琼脂置于PDA上使之萌发生长；将分离出的单孢菌株转入保存培养基中，并置于4℃冰箱中保存备用；2)采用涂菌产孢法制备孢子悬浮液：将保存的各单孢菌株活化于PDA斜面上，从边缘挑取1cm大小的菌丝块转接于OTA平板上，待菌盖扩展至培养皿面积70％左右时，用无菌水洗下培养皿上的菌丝，洗下的菌液涂布于另一番茄燕麦培养基平板上，48h后用无菌水打断皿中长出的气生菌丝，自然晾干后以洁净的纱布覆盖，置于光照培养箱中紫光灯48h促其产孢；用无菌水洗下孢子，过滤、搅匀，加入0.025％Tween‑20通过血板计数器将孢子悬浮液的孢子浓度调整为5×105个孢子/ml；3)待秧苗长至三叶一心时，将孢子悬浮液用小型喷雾器均匀喷洒于鉴定品种的叶片上，至叶片上沾有细密菌液而不滴落为止，每处理3次重复；接种完毕后，在育秧盘上盖上塑料薄膜，于26℃黑暗保湿培养36h，去掉薄膜后光照培养6～7d，期间辅以人工喷雾，保持塑料盘中不断水；每天观察病情待病情稳定后调查；按如下标准记录病情：R抗病：叶片上无病斑或产生针头状褐点或大褐点；S感病：叶片上产生椭圆形或梭形大病斑，中间灰白色，边缘黄褐色；4)待秧苗长至三叶一心时，剪下心叶留取其中间叶段平铺于培养皿中，皿中预先放有浸有无菌水的滤纸，每皿平铺3个叶段，接种前打开培养皿盖用弥雾喷雾器向皿中的叶段上喷洒一层细密的0.025％Tween‑20液体，用移液枪移取菌液点滴于每个叶段之上，每个叶段滴3滴，每滴5μl；盖好培养皿于26℃黑暗保湿培养36h，后光照培养6～7d；每天观察病情待病情稳定后调查；按如下标准记录病情：若接种点中央灰白，有孢子产生，边缘有褪绿，且沿叶脉扩展，记为感病S；接种点无症状或呈黑色，无褪绿且未沿叶脉扩展，记为抗病R；最终反应型以至少出现一处感病病斑为亲和记为1，无病斑或有过敏性坏死症状记为不亲和记为0；每次接种结果成功与否均以丽江新团黑谷表现感病为可靠性指标，试验重复3次；5)秧苗7‑8叶期时，在心叶附近的茎杆部位注射接种孢子悬浮液，接种量100μl，7‑10d后调查；试验重复3次；病级调查参照标准：1级：没有病斑；2级：病斑黑褐色，只有针尖大小，不产分生孢子；3级：病斑长度0.5‑1.0mm，黑褐色，不产分生孢子；4级：病斑较小，长度略大于2.0mm，中心灰色、边缘黄褐色，产孢；5级：病斑较大，长度2.0mm以上，产孢；6级：产孢，大型病斑相互连接；病级统计分析时，1～3级归为抗病反应类型，记为R；4～6级归为感病反应类型，记为S；所述PDA为葡萄糖20g，土豆200g，琼脂粉18g，水1000ml；所述OTA为番茄汁150ml，燕麦200g，琼脂粉18g，水1000ml。