[发明专利]一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法

摘要

本发明公开了一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法，涉及植物病原菌分离技术领域。本方法是：①病原菌的分离；②病原菌的培养；③病原菌的菌落PCR检测；④病原菌的分子鉴定。本发明实现了猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定，具有操作简单、灵敏性高和特异性强等特点，且检测结果准确、客观，对提高猕猴桃溃疡病菌的检测效率及灵敏度具有重要意义；适用于准确检测猕猴桃种苗、亲本资源和育种中间材料在生长早期是否含有猕猴桃溃疡病菌，将有效推动猕猴桃的科研、育种及生产，具有广阔的应用前景。

主权项

一种猕猴桃溃疡病感病样本的快速鉴定方法，其特征在于包括下列步骤：①病原菌的分离将疑似患有细菌性溃疡病的猕猴桃感病样品表面用无菌水冲洗干净，然后用打孔器从感病部位、健康部位和病健交界处分别切取组织，经酒精消毒和无菌水冲洗，再用无菌滤纸吸干表面水分，得到组织切片；将组织切片置于400μL的10mmol/L MgSO₄溶液中进行匀浆，即得匀浆液；②病原菌的培养取100μL的匀浆液涂布在固体KB培养基上，将平板置于27‑28℃培养2d；③病原菌的菌落PCR检测A、模板DNA的制备吸取40μL无菌水置于布满菌落的平板上，用无菌接种环刮擦菌苔，尽可能使平板上的菌落悬浮在无菌水中，形成菌悬液，再将菌悬液置于98℃裂解10min之后涡旋，闪离，吸取2μL上清液用于DNA模板；B、引物序列正向引物为PsaF1：5’‑TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT‑3’；反向引物为PsaR2：5’‑CACGCACCCTTCAATCAGGATG‑3’；预期扩增产物长度为280bp；C、菌落PCR扩增体系反应体系为10μL，其中10×PCR buffer 1μL，10mmol/L dNTP 0.2μL，100μmol/L正向引物PsaF1 0.1μL，100μmol/L反向引物PsaR2 0.1μL，5U/μL Taq酶0.1μL，DMSO 0.2μL，菌落模板2μL，无菌去离子水6.3μL；D、PCR扩增反应程序95℃预变性5min，94℃变性15S，58℃退火30S，72℃ 延伸30S，30个循环，72℃延伸5min，‑20℃保存；E、取PCR扩增产物5μL，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在280bp处出现单一扩增条带的样本初步鉴定含有猕猴桃溃疡病的病原菌；④病原菌的分子鉴定a、模板DNA的制备对于有特异性条带的样本，吸取步骤③中的2μL上清液用于DNA模板；b、引物序列正向扩增引物为gltAFP：5’‑GCCTCBTGCGAGTCGAAGATCACC‑3’；反向扩增引物为gltARP：5’‑CTTGTAVGGRCYGGAGAGCATTTC‑3’；正向测序引物为gltAFS：5’‑CCTGRTCGCCAAGATGCCGAC‑3’；反向测序引物为gltARS：5’‑CGAAGATCACGGTGAACATGCTGG‑3’；    预期扩增产物长度为1000bp；c、菌落PCR扩增体系反应体系为40μL，其中10×PCR buffer 4μL，10mmol/L dNTP 0.8μL，100μmol/L正向扩增引物gltAFP 0.2μL，100μmol/L反向扩增引物gltARP 0.2μL，5U/μL Taq酶0.25μL，DMSO 0.8μL，菌落模板2μL，无菌去离子水31.75μL；d、PCR扩增反应程序95℃预变性5min；94℃变性15S，62℃退火30S，72℃ 延伸30S，30个循环；72℃延伸5min，‑20℃保存；e、取PCR扩增产物40μL，送样测序，正向测序引物为gltAFS，反向测序引物为gltARS；测序结果与NCBI BLAST进行序列比对，如比对结果与Psa菌株相似度达到99%以上，确定该样本中含有猕猴桃溃疡病的病原菌。