[发明专利]一种快速检测土壤中病残体携带TMV方法

摘要

本发明公开了一种快速检测土壤中病残体携带TMV方法，包括土壤中病残体TMV病毒总RNA提取、逆转录制备cDNA模板、LAMP技术体系的建立与优化、电泳检测、特异性与灵敏度检验、样品检测。通过对E.Z.N.A.TM Soil RNA Kit及逆转录体系的改良，LAMP中dNTPmix、MgSO₄、buffer、BstDNA ploymerase、cDNA的用量、反应时间，反应温度等条件进行优化，得到检测烟田土壤中病残体TMV的LAMP技术的最优反应。本发明检测方法快速准确，与普通RT-PCR相比，灵敏度高出100倍，特异性强，无需昂贵器材，只需恒温水浴锅即可完成，田间可操作性强，适合田间样品的快速检测，对烟田TMV病毒病的预防与治理有一定的指导作用。

主权项

一种快速检测土壤中病残体携带TMV方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取土壤中病残体TMV总RNA；(2)以提取的总RNA为模板，逆转录得到cDNA；(3)以cDNA为模板，用以下两对引物进行LAMP扩增，得到扩增产物；第1对引物：TMV‑FIP5'‑GCTGTGACTAACGGATCTAATACCG‑AGGTTCCCTGACAGTGAC‑3'TMV‑BIP5'‑GAAGTTGAAAATCAGGCGAACCC‑TGCGTCGTCTACTCTACG‑3'第2对引物：TMV‑F3：5'‑GGAAACCTTCACCACAAGT‑3' TMV‑B3：5'‑TATAGCGCTCCTTATGGC‑3' (4)用TAE电泳缓冲液配制2％琼脂糖凝胶，取5μL LAMP扩增产物在水平电泳槽中进行电泳，110V/100mA电泳35min，得到目标TMV的瀑布离散型条带。