[发明专利]一种用于弓形虫病防治的可复制型RNA疫苗及构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种用于弓形虫病防治的可复制型RNA疫苗，所述疫苗是将弓形虫抗原基因NTPase‑II插入到甲病毒载体RREP上，获得重组质粒pRREP‑NTPase‑II，免疫前，将该重组质粒体外转录成RNA后，即可获得所述可复制型RNA疫苗。本发明采用可复制型RNA疫苗对BALB/c小鼠进行主动免疫后，通过测定免疫鼠的细胞和体液免疫指标来评价疫苗的免疫原性，通过观察急性弓形虫感染小鼠存活时间，同时计数慢性弓形虫感染小鼠的大脑中包囊数评估疫苗的免疫保护性，该疫苗可有效地增强体液免疫和细胞免疫反应，既可有效延长免疫小鼠在弓形虫RH株(I型)攻击后的存活时间，又可降低免疫小鼠在接受弓形虫PRU株(II型)攻击后大脑包囊的形成率。该疫苗可作为预防弓形虫急、慢性感染有效候选疫苗。

主权项

1.一种用于弓形虫病防治的可复制型RNA疫苗，其特征在于：所述疫苗是将弓形虫抗原基因NTPase‑II插入到甲病毒载体RREP上，获得重组质粒pRREP‑NTPase‑II，免疫前，将该重组质粒体外转录成RNA后，即可获得所述可复制型RNA疫苗；所述NTPase‑II是弓形虫的核苷三磷酸水解酶，与弓形虫的生存和繁殖有关，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体步骤如下：以弓形虫RH株DNA作为模板，通过聚合酶链式反应扩增获得NTPase‑II基因片段,并插入到甲病毒载体pRREP‑EGFP的XmaI和SpeI位点间，替换EGFP基因，产生pRREP‑NTPase‑II重组质粒，重组质粒经PCR和测序鉴定，用质粒大提试剂盒大量提取质粒，凝胶电泳显示重组质粒的构建和鉴定，将质粒DNA以BspQI酶切线性化后，体外转录为RNA后对其进行加帽处理，即得可复制型RNA疫苗；具体步骤如下：⑴设计特异性引物：根据弓形虫RH株NTPase‑II基因序列，该基因序列去除信号肽，设计一对特异性引物NTPase‑II上游引物和NTPase‑II下游引物，在引物5’端分别引入XmaI和Spe I酶切位点，所述一对特异性引物的序列如下所示：NTPase‑II上游引物：SEQ ID NO.2；NTPase‑II下游引物：SEQ ID NO.3；⑵NTPase‑II基因扩增：以弓形虫RH株DNA为模板，用KAPAHiFi高保真酶扩增NTPase‑II基因，PCR反应体系和反应条件如下：PCR反应条件：预变性95℃5min，变性98℃20s，退火60℃15s，延伸72℃1min，共32个循环，终延伸72℃2min；取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，获得预期大小1815bp的目的条带，剩余的PCR产物纯化回收，得NTPase‑II片段；⑶NTPase‑II目的片段及载体的双酶切和回收：NTPase‑II片段和pRREP‑EGFP载体用XmaI和Spe I进行双酶切37℃过夜，NTPase‑II片段酶切产物纯化回收，得NTPase‑II目的片段；pRREP‑EGFP质粒酶切产物，经琼脂糖凝胶电泳分离，获得10749bp的pRREP大片段和720bp的EGFP片段，回收其大片段，得pRREP载体；⑷NTPase‑II目的片段与载体的连接与转化：将回收得到的NTPase‑II目的片段与pRREP载体用T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，得连接产物，然后将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中；⑸重组质粒的鉴定：挑取若干个大肠杆菌DH5α单菌落做菌液PCR鉴定，阳性菌株进行测序鉴定，pRREP‑NTPase‑II重组质粒构建完成；⑹重组质粒的大量提取：将pRREP‑NTPase‑II重组菌大量摇菌，按照常规方法提取质粒；⑺质粒线性化选用载体RREP上插入基因下游polyA后的BspQI作为线性化的位点，将质粒pRREP‑EGFP和pRREP‑NTPase‑II分别经BspQI酶切过夜，酶切产物去酶纯化后，作为体外转录的模板；⑻体外转录使用体外转录试剂盒将pRREP‑EGFP和pRREP‑NTPase‑II分别体外转录成RNA，体外转录产物RNA，经LiCl沉淀纯化，分别得RREP‑EGFP、RREP‑NTPase‑II RNA；⑼转录产物加帽使用试剂盒牛痘病毒加帽系统，将体外转录的RREP‑EGFP、RREP‑NTPase‑II RNA进行加帽，加帽产物用LiCl沉淀法纯化回收，即获得可复制型RNA疫苗；所述步骤⑻中体外转录的具体条件为：体外转录反应体系如下：ATG 2μl，CTP 2μl，GTP 2μl，UTP 2μl，10×反应缓冲液2μl，线性化DNA模板1μg，RNA聚合酶2μl，RNA酶抑制剂1μl，用去核酸酶双蒸水定量至20μl；反应条件：混匀，37℃反应12h，取0.5μl转录产物经普通琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余的体外转录产物加入1μl TURBO RNase，37℃孵育15min，去除模板DNA；所述步骤⑼中加帽的具体条件为：加帽反应体系如下：RNA 10μg，无RNA酶双蒸水定量至20μl，65℃10min,立即放冰上5min,使RNA变性，去除二级结构；10×加帽反应缓冲液2μl，10mM GTP 1μl，32mM SAM 1μl，RNA酶抑制剂1μl，牛痘加帽酶1μl，温和混匀，37℃温育1h；所述步骤⑺中BspQI酶为NEB,#R0712S；所述步骤⑻中体外转录试剂盒为MEGAScriptTMKit，Ambion,AM1330M；或者，所述步骤⑼中试剂盒为牛痘病毒加帽系统NEB,#M2080S。