[发明专利]一种禽流感全病毒颗粒标记疫苗的制备方法及其产品和用途

摘要

本发明公开了一种禽流感标记疫苗的制备方法及其产品和用途。所述方法包括：a)病毒培养；b)膜深层过滤、微滤、超滤；c)甲醛灭活；d)亲和层析以及在柱核酸酶解；e)疏水反应层析纯化；f)透析，除菌过滤；g)乳化。本发明提供的禽流感标记疫苗抗原为均一完整的禽流感病毒颗粒，不含禽流感病毒的非结构蛋白，不含未成熟的其他大小、形状的病毒颗粒。注入动物体内只产生针对禽流感病毒表面抗原的抗体，血凝素抗体和神经氨酸酶抗体，因此，能够完全区别动物感染和免疫禽流感病毒，有效降低了疫苗注射引起动物潜在过敏反应风险，降低了动物传染病如新城疫、禽流感等传播的潜在风险，安全性高，对动物食品安全和贸易没有影响。

主权项

1.一种禽流感全病毒颗粒标记疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：a)病毒培养10000L生物反应器全悬浮培养MDCK细胞，细胞密度达到3‑5×106个/ml，按照感染复数MOI0.01‑0.1接种禽流感病毒MDCK细胞适应株，加入胰酶，使其终浓度达到50μg/mL，搅拌速度不超过40rpm，4天收获病毒液，用制备型低速连续流离心机离心除去细胞碎片，同时收获上清液和沉淀；沉淀在Triton‑X‑100存在的条件下裂解禽流感病毒感染细胞和细胞膜碎片，所述Triton‑X‑100的终浓度为1‑2％(v/v)，反复冻融3次后超声3次，用制备型低速连续流离心机离心收集上清液，合并上清液；该步骤的质量控制指标为：禽流感病毒滴度为≥107logTCID50/mL，禽流感病毒血凝素含量为≥30μg/ml，TritonX‑100残余量≤600μg/ml,抗生素残余量为≤180μg/ml；b)膜深层过滤、微滤、超滤步骤a)得到的病毒上清液，依次经过0.65微米的膜深层过滤以及0.45微米孔径的滤膜微滤后，经膜孔截留值为750,000‑1000,000MWCO的切向流超滤膜超滤，进一步除去完整的MDCK细胞和大分子物质；该步骤的质量控制指标为：禽流感病毒滴度为≥107logTCID50/mL，禽流感病毒血凝素含量为≥20μg/ml，内毒素含量≤40EU/ml；c)灭活；甲醛灭活，灭活条件：2‑8℃，时间7‑10天；灭活澄清液经膜孔截留值为750,000‑1000,000MWCO的切向流超滤膜超滤，进一步除去小分子杂质和缩小体积以便纯化；该步骤的质量控制指标为：禽流感病毒血凝素含量为≥20μg/ml，Triton‑X‑100残余量≤50μg/ml，甲醛残余量≤300μg/ml；内毒素含量≤40EU/ml；d)亲和层析以及在柱核酸酶解：包括：(1)采用硫酸纤维素或肝素作为亲和层析介质，将灭活后的禽流感病毒澄清液吸附在介质上，洗脱细胞DNA和细胞蛋白，吸附液为pH7.4的100mM柠檬酸，流感病毒颗粒洗脱液为pH 7.4的含2M氯化钠的100mM柠檬酸；(2)经过步骤(1)操作后，用非特异的核酸酶进行在柱酶解；(3)经步骤(2)操作后洗涤层析介质，洗脱禽流感病毒；该步骤的质量控制指标为：体积为2000L，禽流感病毒血凝素含量≥100μg/ml，MDCK细胞蛋白残余量≤50ng/ml，MDCK细胞残余DNA量≤1000pg/ml，M2蛋白含量≤100ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤100ng/ml，Triton‑X‑100残余量≤50μg/ml；甲醛残余量≤50μg/ml，内毒素含量≤30EU/ml；e)疏水反应层析步骤d)洗脱后的禽流感病毒液上样于苯基琼脂糖疏水层析柱，洗脱禽流感病毒，吸附缓冲液为pH,7.4的含1.7M硫酸铵的50M磷酸二氢钾，洗脱缓冲液为pH,7.4的50M磷酸二氢钾，得到纯化后的禽流感病毒液；该步骤的质量控制指标为：体积为2000L，禽流感病毒血凝素含量≥100μg/ml，MDCK细胞蛋白残余量≤30ng/ml，MDCK细胞残余DNA量≤500pg/ml，M2蛋白含量≤50ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤50ng/ml，Triton‑X‑100残余量≤50μg/ml；甲醛残余量≤50μg/ml，内毒素含量≤30EU/ml；f)透析、除菌过滤经步骤d)纯化后的禽流感病毒液稀释为10000L，进行透析，透析后的病毒液经0.22μm膜除菌过滤；该步骤质量控制指标为：禽流感病毒血凝素含量≥40μg/ml，内毒素含量≤10EU/ml，MDCK细胞蛋白残余量≤10ng/ml，MDCK细胞DNA残余量≤100pg/ml，甲醛残余量≤50μg/ml，Triton X‑100残余量≤5μg/ml，禽流感M2蛋白含量≤10ng/ml，牛血清白蛋白残余量≤20ng/ml；g)乳化：采用适宜的水包油包水佐剂进行乳化即得。