[发明专利]一种使用磁微粒化学发光定量检测抗SS-B抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法

摘要

本发明涉及免疫学检测技术领域，具体涉及一种使用磁微粒化学发光定量检测抗SS‑B抗体IgG的试剂盒及其制备方法和检测方法。本发明提供的一种使用磁微粒化学发光定量检测抗SS‑B抗体IgG的试剂盒，包括Anti‑SS‑B IgG校准品、Anti‑SS‑B IgG试剂1号、Anti‑SS‑B IgG试剂2号、Anti‑SS‑B IgG磁分离试剂、Anti‑SS‑B IgG质控品和清洗液。本发明还公开了上述试剂盒的制备和检测方法。该检测方法在传统的膜条免疫法和酶联免疫吸附法的基础上，将灵敏度和线性范围再提高了3‑5个数量级、实现了定量检测，具有敏感度高、特异性强、准确性好、成本低、操作简便和结果判断客观优点，并配合全自动化学发光免疫分析仪实现全自动使用，具有广阔的应用前景。

主权项

1.一种使用磁微粒化学发光定量检测抗SS‑B抗体IgG的试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：步骤1.制备Anti‑SS‑B IgG校准品包括Anti‑SS‑B IgG校准品稀释液配制步骤和Anti‑SS‑B IgG校准品配制步骤：所述Anti‑SS‑B IgG校准品稀释液的配制步骤包括：加800mL纯化水和11.2g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.5g的氯化钠和2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0‑7.5，加40g的牛血清白蛋白到容器中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为7.0‑7.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述校准品稀释液保存在2‑8℃待用；所述Anti‑SS‑B IgG校准品的配制步骤包括：用上述Anti‑SS‑B IgG校准品稀释液将抗SS‑B抗体IgG分别配制为0、5、20、50、100、200RU/mL共6个浓度点；步骤2.制备Anti‑SS‑B IgG试剂1号包括Anti‑SS‑B IgG试剂1号稀释液配制步骤和Anti‑SS‑B IgG试剂1号配制步骤：所述Anti‑SS‑B IgG试剂1号稀释液的配制步骤：加800mL纯化水、12.1g的Tris和5.8g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.0‑7.5，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述试剂1号稀释液保存在2‑8℃待用；所述Anti‑SS‑B IgG试剂1号的配制步骤：用0.2mol/L的pH9.0碳酸盐缓冲液配制0.5mg/mL的生物素溶液，按照SS‑B抗原与生物素溶液质量比为10:1的比例在SS‑B抗原溶液中加入到上述0.5mg/mL的生物素溶液，混合均匀，室温静置18h，反应生成SS‑B抗原‑生物素连接物的反应液，将得到的SS‑B抗原‑生物素连接物反应液通过G‑25凝胶柱进行分离，除去未反应的生物素，得到SS‑B抗原‑生物素连接物，再用所述试剂1号稀释液将SS‑B抗原‑生物素连接物稀释到0.1‑0.3μg/mL，得到所述的试剂1号；步骤3.制备Anti‑SS‑B IgG试剂2号包括：Anti‑SS‑B IgG试剂2号稀释液配制步骤和Anti‑SS‑B IgG试剂2号的配制步骤：所述Anti‑SS‑B IgG试剂2号稀释液的配制步骤：加800mL纯化水、6.06g的4‑羟乙基哌嗪乙磺和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0.1g的ZnCl2、0.2mL的Proclin 300和0.1g的MgCl2，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.5‑8.0，用纯化水定容至1L，使用0.2um滤器过滤，将获得的所述试剂2号稀释液保存在2‑8℃待用；所述Anti‑SS‑B IgG试剂2号的配制步骤：将1mg的羊抗人抗体和2‑4μL的10mg/mL的偶联剂为2‑亚胺四氢噻吩溶液，室温静置20min，加入0.1mol/L的甘氨酸溶液10μL，室温静置5min，用G‑25凝胶柱除盐，收集活化后抗体，将活化后的抗体保存在2‑8℃备用，取1.5mg的碱性磷酸酶，加入5mg/mL的4‑(N‑马来酰亚胺基甲基)环己烷‑1‑羧酸琥珀酰亚胺酯溶液10‑20μL，室温静置30min，用G‑25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，将活化后的碱性磷酸酶保存在2‑8℃备用，再将上述活化的羊抗人抗体与活化的碱性磷酸酶混合，在2‑8℃条件下静置12‑24h，用Supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得羊抗人抗体‑碱性磷酸酶连接物浓溶液，置于2‑8℃保存备用，将羊抗人抗体‑碱性磷酸酶连接物浓溶液用所述试剂2号稀释液稀释到0.02‑0.1μg/mL，得到所述的试剂2号；步骤4.制备Anti‑SS‑B IgG磁分离试剂包括Anti‑SS‑B IgG磁分离试剂稀释液配制步骤和Anti‑SS‑B IgG磁分离试剂配制步骤：所述Anti‑SS‑B IgG磁分离试剂稀释液配制步骤：加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl到容器中，搅拌至完全溶解，再加5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0.2mL的Proclin300，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.9‑8.1，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述磁分离试剂稀释液保存在2‑8℃待用；所述Anti‑SS‑B IgG磁分离试剂配制步骤：取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用0.025mol/L的pH值为4.5‑6的2‑吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温下混匀2～3h，加入0.5‑1.0mL新配制的浓度为10mg/mL的碳二亚胺和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺的吗啉乙磺酸缓冲液，室温振荡混悬30‑60min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用0.025mol/L的pH值为4.5‑6的2‑吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，加入4‑8mg的链霉亲和素，室温混悬16‑20h，再进行磁分离，去上清，用百分比浓度0.5％的牛血清白蛋白，百分比浓度0.5％脱脂奶粉和百分比浓度0.05％吐温‑20的2‑吗啉乙磺酸缓冲液10mL重悬，室温条件下混匀2～3h，再磁分离，去上清，用磁微粒缓冲液稀释重悬到0.5mg/mL，在2～8℃下平衡16～24h，室温条件下混匀2～3h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述Anti‑SS‑B IgG磁分离试剂；所述制备方法包括清洗液的制备步骤：加800mL纯化水、12.1g的Tris和8.5g的NaCl于1L容器中，搅拌至完全溶解，再加入5g的吐温‑20和5g的Triton100，搅拌，直至完全混匀，将pH值调为7.5‑8.0，定容1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述清洗液保存在2‑8℃待用，使用前将所述清洗液按照每7.5mL加纯化水至100mL比例稀释并混匀。