[发明专利]一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法

摘要

本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，公开了一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法。其包括以下操作步骤：将小桐子组培苗叶片切成0.5～1mm宽的叶条，置于酶解液中避光、22～25℃静置酶解6～7h，过滤洗涤原生质体，加入一定的质粒DNA、原生质体和PEG4000/Ca²⁺溶液处理后，培养18～40h后在激光扫描共聚焦显微镜下观察。

主权项

一种小桐子组培苗原生质体的制备及基因瞬时表达的方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)称取1.82g甘露醇溶于20ml双蒸水中，配制甘露醇溶液装在灭菌小烧杯里；(2)在超净台上取小桐子组培苗叶片，用刀片切成0.5～1mm宽的叶条，将切好叶条放入甘露醇溶液中；(3)将叶条捞出放入预先配好的装有15ml酶解液的50ml锥形瓶中，避光，22～25℃静置酶解6～7h；当酶解液变绿时摇晃锥形瓶，促使原生质体释放出来；(4)加入15ml等体积预冷的W5溶液，用100目的滤网进行过滤，滤液于50ml圆底离心管中置于冰上；(5)用离心力80g离心2min，去除上清，沿管壁加入5ml预冷的W5溶液，冰上放置30min，同时取20μl溶液用细胞计数板计数；(6)原生质体沉淀在离心管底部，去除上清，用MMg溶液将原生质体悬浮制成浓度为2х10⁵个/mL的原生质体悬浮液；(7)在2ml的灭菌离心管中加入10μl的质粒DNA溶液；质粒DNA溶液中含有10～20μg质粒DNA；(8)向步骤(7)所得质粒DNA溶液中加入100μl步骤(6)所得原生质体悬浮液；(9)再加入110μl PEG4000/Ca²⁺溶液，用剪头的枪头吸打混匀；(10)22～25℃下避光诱导转化混合物15～30min；(11)加入440μl的W5溶液稀释转化混合液，然后颠倒离心管使之混合以终止转化反应；(12)80g离心2min然后去除上清；(13)再用1ml的W5溶液重悬原生质体于六孔组织培养皿中，在W5溶液中加入50μl/ml氨苄青霉素；(14)在避光和23℃条件下培养原生质体18～40h；(15)用离心力80g离心2min，然后去上清，留下10～20μl的溶液，在激光扫描共聚焦显微镜下观察基因瞬时表达；所述酶解液是按照以下方法制备得到：将纤维素酶R10、离析酶R10、甘露醇、氯化钾和pH为5.7的2‑吗啉乙磺酸加入到ddH₂O中混合后，55℃水浴加热10分钟；冷却至室温后加入氯化钙、牛血清蛋白和β‑巯基乙醇，用0.45μm滤膜过滤后，得到酶解液；各组分在酶解液中的浓度如下：质量分数2.0﹪的纤维素酶R10、质量分数0.4﹪的离析酶R10、0.4M甘露醇、20mM氯化钾、20mM 2‑吗啉乙磺酸、10mM氯化钙、质量分数0.1﹪的牛血清蛋白、50μlβ‑巯基乙醇；所述W5溶液是按照以下方法制备得到：将葡萄糖、氯化钠、氯化钙、氯化钾和pH为5.7的2‑吗啉乙磺酸混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在W5溶液中的浓度如下：5mM葡萄糖、154mM氯化钠、125mM氯化钙、5mM氯化钾、2mM 2‑吗啉乙磺酸；所述MMg溶液是按照以下方法制备得到：将氯化镁、pH为5.7的2‑吗啉乙磺酸和0.4M甘露醇混合后，用0.45μm滤膜过滤后使用；各组分在MMg溶液中的浓度如下：15mM氯化镁、4mM 2‑吗啉乙磺酸、0.4M甘露醇；所述PEG4000/Ca²⁺溶液是按照以下方法制备得到：将PEG4000、甘露醇和氯化钙混合后，用无菌水定容至1ml；各组分在PEG4000/Ca²⁺溶液中的浓度如下：质量体积分数40％的PEG4000、0.2M甘露醇、100mM氯化钙。