[发明专利]一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法

摘要

一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，选用细胞系代替鸡胚进行鸡传染性喉气管炎病毒液的增殖，经培养细胞系、克隆纯化、传代、培养、病毒株的克隆、培养、疫苗配制、收获制苗毒液、分装、冻干等工序制成。本发明用传代细胞生产鸡传染性喉气管炎活疫苗，降低了生产成本，减少了疫苗免疫副反应问题，缩小了批间差异性，保证了疫苗质量的稳定，并为实现所述病毒的规模化培养奠定了基础。实验表明，本发明克隆方法仅通过3次克隆便可获得无细胞内杂质、透亮、圆润、轮廓清晰的细胞，而现有方法需要克隆7次，可见本方法缩短了克隆时长，并在克隆中具有高活性及高几率的克隆几率。

主权项

一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，其选用细胞系代替鸡胚进行鸡传染性喉气管炎病毒液的增殖，步骤如下：（1）筛选鸡传染性喉气管炎病毒培养细胞系：根据鸡传染性喉气管炎病毒生物学特性，选取BHK‑21细胞、Vero细胞、DF1细胞、原代鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡胚肝细胞、鸡胚肾细胞，前两种细胞采用DMEM培养液进行培养，后四种细胞使用M199培养液，分别进行所述病毒的培养，得病毒株适应性细胞；（2）筛选细胞的克隆纯化：对步骤（1）中所得的病毒株适应性细胞用8%胎牛血清培养液进行稀释，稀释浓度为2个细胞/ml，加入48孔细胞板中，0.3ml/孔进行细胞克隆培养，选取细胞生长均一、轮廓清晰、透亮，细胞内无杂质的细胞孔进行消化冻存备用；（3）制苗细胞的传代、培养：（4）病毒株的克隆、培养：采用步骤（2）中的克隆细胞进行病毒株的蚀斑克隆培养，共克隆四次，一次克隆分别选取三个最小蚀斑，分别进行后三次的克隆，最终分别繁殖克隆三个毒株，筛选出毒力最弱、免疫原性最强的制苗毒株，并对所述毒株进行适应性培养；（5）制苗用毒液的制备：用M199培养液对步骤（4）制苗毒株进行稀释，接种于长满单层的制苗细胞中，于培养箱中吸附，待吸附后弃去稀释液，补加细胞维持液，进行病毒的培养，最终收获细胞悬液备用；（6）疫苗的配制及分装：收获步骤（5）中的制苗毒液，加入保护剂，充分混匀，定量分装；（7）冻干。