[发明专利]一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法及应用，属于细菌遗传改造技术领域。本发明中通过在上游引物中添加USS序列ACCGCTTG，使的PCR产物含有这个USS序列，副猪嗜血杆菌会识别并带入菌体内部进行重组，无需构建突变常用的自杀质粒，本方法把抗性基因直接引入到PCR产物中，直接用PCR产物就能实现筛选，同时在引物中引入USS，细菌就会直接吞噬这个重组模版用于同源重组。本发明的基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法在构建副猪嗜血杆菌双组分系统突变体中应用。

主权项

1.一种基于自然转化的副猪嗜血杆菌高效遗传重组方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1)以副猪嗜血杆菌基因组为模板，设计重组目标基因的上臂扩增引物对和下臂扩增引物对，分别扩增获得目标基因上臂片段和目标基因下臂片段，其中所述的上臂扩增引物对的上游引物中包含USS序列；2)扩增获得抗性标记基因，所述的抗性标记基因的前端序列与目标基因上臂片段后端序列存在部分重叠，所述的抗性标记基因的后端序列与目标基因下臂片段前端存在部分重叠片段，以目标基因上臂片段的上游扩增引物和目标基因下臂片段的下游扩增引物进行重叠PCR扩增，获得依次排列有USS序列、目标基因上臂片段、抗性标记基因和目标基因下臂片段的重组片段PCR产物；3)将步骤2)获得重组片段与受体副猪嗜血杆菌进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得副猪嗜血杆菌的重组突变体；步骤3)中所述的自然转化，具有步骤如下：将受体副猪嗜血杆菌接种于TSA平板，含5％CO2培养箱37℃培养24h，之后用TSB把菌体从平板中冲洗下来，用TSB培养基把菌体浓度调整为109cfu/ml；取20μL菌液置于TSA平板上，加入1μg步骤2)获得的重组片段PCR产物，用接种环混合后置于培养箱中37℃培养5h，之后用TSB再次把菌体洗下，离心，去上清后加入100μL TSB培养基悬浮菌体，然后把菌液涂布在含有Gm的TSA平板上，37℃培养2天，完成自然转化，同时用TE buffer做阴对照。