[发明专利]一种快速测定脱氧核糖核酸甲基化率的方法

摘要

本发明是涉及一种快速测定脱氧核糖核酸甲基化率的方法，属于分子生物学及遗传学领域。本发明主要是采用了新的DNA序列检测方法。步骤主要包括引物和探针设计，重亚硫酸盐转化、序列扩增、探针杂交和探针检测(采用检测探针和竞争探针同时杂交提高检测精度)和DNA甲基化率确定，在效率上远远高于目前的方法，时间短，价格也便宜，具有广阔应用前景。

主权项

1.一种快速测定脱氧核糖核酸甲基化率的方法，用于非诊断目的，其特征在于包括下列步骤：1)引物和探针合成：根据目的基因序列，设计引物和探针，正向引物用生物素标记；所述探针包括甲基化序列的检测探针及竞争探针，非甲基化序列的检测探针及竞争探针；检测探针用地高辛标记；2)杂交液配置：含有甲基化序列探针杂交缓冲液：5倍SCC缓冲液，0.3％Tween‑20,10pmol甲基化序列检测探针，100pmol甲基化序列的竞争探针；非甲基化序列探针杂交缓冲液：5倍SCC缓冲液，0.3％Tween‑20,10pmol非甲基化序列检测探针，100pmol非甲基化序列的竞争探针；3)DNA甲基化比例测定：a)解双链的DNA经重亚硫酸盐转化处理，b)采用步骤1)中设计的引物，以步骤a)转化后DNA作为模板进行PCR扩增；c)杂交：将得到的PCR产物分成两份，分别与链酶亲和素包裹的磁力球结合，加入变性溶液；PBST缓冲液清洗，然后分别加入含有甲基化序列探针杂交缓冲液和非甲基化序列探针杂交缓冲液，50℃杂交2h；d)信号测定：利用酶标仪在405nm检测反应颜色浓度，根据甲基化和非甲基化的颜色浓度比值，计算出DNA甲基化百分比。