[发明专利]小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法

摘要

本发明以冬小麦栽培品种京411、Brock和春麦S10鉴-6、春麦津强5号四种小麦成熟胚为外植体，进行愈伤组织诱导、分化及再生体系优化，构建高效脱分化、再生植株以及获得再生籽粒系统：成熟胚采用纵切处理，愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg·L^-12,4-D+200mg·L^-1CH+100mg·L^-1MI+250mg·L^-1Glu，分化和植株再生培养基为MS+10mg·L^-1ZT+0.1mg·L^-1IAA，分化率为100%，成苗率为49.33%，生根培养基为1/2MS，生根后的试管苗经过炼苗、大田移栽及移栽后管理，可以收获再生籽粒。与已有京411再生体系的报道相比，本研究的植株再生率显著提高。本研究建立的京411成熟胚组织培养及再生体系为后续的转基因研究提供了良好的受体材料。

主权项

小麦成熟胚愈伤组织诱导培养及植株再生体系的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）植物材料：选取色泽、大小均匀的冬小麦栽培品种，70%(w/w)酒精处理5min，无菌水冲洗2‑3次，用50%(w/w)次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗3次，4℃冷藏2h后取出再用无菌水冲洗一次；所述的小麦栽培品种指的是：京411；（2）诱导和再生培养基的筛选：通过对6个诱导培养基、8个分化培养基的筛选，获得成熟胚从脱分化到再分化以及形成再生苗的系统为：愈伤组织诱导培养基为MS+2.0mg·L^‑12,4‑D+200mg·L^‑1CH+100mg·L^‑1MI+250mg·L^‑1Glu，分化和植株再生培养基为MS+10mg·L^‑1ZT + 0.1 mg·L^‑1IAA，生根培养基为1/2MS；以上所有培养基均添加30g·L^‑1蔗糖，琼脂粉8.5g·L^‑1，PH 5.8，在121℃下经1.1kg/cm²高压湿热灭菌20min；（3）成熟胚的处理和诱导：取步骤（1）中消毒并低温处理好的种子，不去掉胚乳，将胚纵向全切但胚乳不完全切开，置于诱导培养基，直径6cm的培养皿，平均每皿接种20个，25℃暗培养，在培养皿上标明品种、培养基、日期和接种外植体数，培养10d后统计出愈率，挑选胚性愈伤组织继代，每周继代一次，继代四次后转入分化培养基进行光照培养，光强2000Lux，每天光照16h，培养温度为25℃，每15d继代一次，30d后统计愈伤组织分化率及出苗率，待分化苗长至3‑4cm时接入生根培养基进行生根培养，30d后统计植株生根率；（4） 组培苗的管理：待试管苗的根长4‑5cm，生长一个月后将其炼苗培养，炼苗营养土为经高压蒸汽灭菌后的泥炭土、蛭石和珍珠岩，其泥炭土：蛭石：珍珠岩的质量比为6:3:1，炼苗培养2周后将苗移栽至田间，定期管理，直至植株成熟收获；愈伤组织继代4次后转移到分化培养基上进行再分化，大部分愈伤组织在一周后开始分化，长出绿点，15天后开始出现植株幼苗，25天后幼苗长至3‑4cm高时，接入1/2MS生根培养基，生根培养30天后移栽炼苗，田间炼苗2周后植株移栽至田间，用一薄层芦苇草覆盖田间麦苗，翌年3月初组培苗正常返青，4月可发现植株分蘖，植株数量明显增多，茎干粗壮，5月初植株开始抽穗，待麦穗成熟后收割，平均每颗穗约收51粒种子。