[发明专利]一种托品酰胺人工抗原的制备方法

摘要

本发明提供了一种托品酰胺人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以托品酰胺与丁二酸酐进行酰化反应得到含羧基的化合物，该化合物和甘氨酸乙酯盐酸盐经缩合反应和水解反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过混合酸酐法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备托品酰胺的人工抗原即托品酰胺‑牛丙种球蛋白。所制备的托品酰胺人工抗原可进行动物免疫，取得相应的托品酰胺抗体，可用于托品酰胺免疫分析法的研究，为托品酰胺的检测提供更加方便快速准确的途径。

主权项

1.一种托品酰胺人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 制备人工半抗原：(a) 将托品酰胺与丁二酸酐以摩尔比为1:1.5加入单口圆底烧瓶中，用吡啶溶解，在100℃油浴下，搅拌回流20小时；结束反应，冷却至室温，减压转干，并用少量乙醇共沸，浓缩后，经薄层色谱法分离得微黄色固体产物Ⅰ；薄层层析：层析液以体积比计为95%乙醇:1,4‑二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1，产物Rf =0.3；(b) 将产物Ⅰ与甘氨酸乙酯盐酸盐和1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以摩尔比为1:1.15:2溶于吡啶中，氮气气氛中，室温搅拌反应18小时；反应结束，转干，用少量乙醇共沸，得到的残渣加入PBS，用氯仿萃取两次，得到的有机相再用双蒸水洗，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状物Ⅱ；薄层层析：层析液以体积比计为95%乙醇:1,4‑二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1，产物Rf =0.7；(c) 将黄色油状物Ⅱ溶于四氢呋喃和甲醇中，加入1N的NaOH水溶液，室温搅拌反应4小时；结束反应，蒸干溶剂，用1N的盐酸调pH=3，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状残渣，经薄层色谱分离得黄色油状物Ⅲ即托品酰胺半抗原；薄层层析：层析液以体积比计为95%乙醇:1,4‑二氧六环:二氯甲烷:氨水=8:1:10:1，产物Rf =0.2；(2) 制备托品酰胺人工抗原：(d) 将托品酰胺半抗原Ⅲ溶于N,N‑二甲基甲酰胺，随后加入三乙胺和氯甲酸乙丁酯，室温避光搅拌反应15小时，形成溶液A；(e) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；(f) 将牛丙种球蛋白溶于PBS缓冲液中，浓度为5mg/ml，形成B液；(g) 将溶液A缓慢逐滴滴加到溶液B中，边滴边搅拌，A液与B液的体积比为1:5，室温搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存18小时，得到人工抗原混合液；(h) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：托品酰胺‑牛丙种球蛋白。