[发明专利]一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法与应用

摘要

本发明涉及一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法与应用。将来源于噬尼古丁节杆菌的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY和麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ融合通过前后添加糖化酶基因的上下游片段的同源臂Gla5和Gla3，先通过构建中间载体，再构建得到TreY-TreZ融合基因转化黑曲霉载体pEASY-TreY-TreZ，农杆菌介导的TreY-TreZ融合基因同源重组转化黑曲霉载体pFGL59-TreY-TreZ。农杆菌AGL1介导转化，最后得到纯合的消除潮霉素基因hph的同源重组黑曲霉工程菌。本发明制得的重组黑曲霉工程菌，液化淀粉对其诱导表达效果优于其它诱导型的表达效果。

主权项

一种制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分别PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ，同时PCR扩增黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5和下游基因片段Gla3、Gla3a；所述的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；所述的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；所述的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3a的核苷酸序列如SEQ ID NO.3；(2)采用重叠PCR技术，将步骤(1)制得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因TreY与麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因TreZ拼接，制得TreY‑TreZ融合基因片段，TreY‑TreZ融合基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示以及氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，然后将步骤(1)制得的黑曲霉糖化酶基因的上游基因片段Gla5与TreY‑TreZ融合基因拼接，制得Gla5‑TreY‑TreZ片段，然后将黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3与Gla5‑TreY‑TreZ片段拼接，制得Gla5‑TreY‑TreZ‑Gla3片段；(3)将步骤(2)制得的Gla5‑TreY‑TreZ‑Gla3片段与pMD18‑T Simple连接，获得重组质粒pSimple‑TreY‑TreZ；将步骤(1)制得的黑曲霉糖化酶基因的下游基因片段Gla3a与pMD18‑T载体连接，制得pMD‑Gla3a质粒；(4)用XbaI、BamHI双酶切载体pAN7‑1，回收6031bp的基因片段，XbaI、BglII双酶切步骤(3)制得的pMD‑Gla3a质粒，回收1213bp的基因片段，连接上述回收的基因片段，构建载体pAN‑Gla3a；(5)在Gla5基因上游引物5’端引入一个XbaI位点，然后与pEASY‑Blunt载体连接，构建质粒载体pEASY‑Gla5；(6)用限制性内切酶XbaI、XhoI、DraI三酶切步骤(4)制得的载体pAN‑Gla3a，回收3470bp的基因片段，XhoI、SpeI双酶切步骤(5)制得的质粒pEASY‑Gla5，回收3785bp的基因片段，连接上述回收的基因片段，构建载体pEASY‑hph；(7)用限制性内切酶XbaI、XhoI双酶切步骤(6)制得的载体pEASY‑hph和步骤(3)制得的重组质粒pSimple‑TreY‑TreZ，回收7392bp与6367bp的基因片段，连接上述回收的基因片段，构建载体pEASY‑TreY‑TreZ；(8)用限制性内切酶XbaI、HindIII双酶切步骤(7)制得的载体pEASY‑TreY‑TreZ和载体pFGL59，回收9831bp和7339bp的基因片段，连接上述回收的基因片段，制得pFGL59‑TreY‑TreZ载体；(9)将pFGL59‑TreY‑TreZ载体通过根癌农杆菌AGL1介导的黑曲霉转化法转化到黑曲霉F0410中，经筛选，获得制备食品级海藻糖的黑曲霉工程菌。