[发明专利]一株重组大肠杆菌及其在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用

摘要

本发明公开了一株重组大肠杆菌，所述菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet‑S33[2Fe2S]Fd，该菌株含有来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)S33的[2Fe2S]铁氧还蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组大肠杆菌是将[2Fe2S]铁氧还蛋白基因连接入pETDuet‑1载体，制得重组质粒命名为pETDuet‑[2Fe2S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coli C41(DE3)中获得。本发明还公开了所述重组大肠杆菌在发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白中的应用，实验证实：每升发酵培养物最终可以获得23mg纯化后的[2Fe2S]铁氧还蛋白，远大于之前报道的从野生菌中纯化出来的0.03mg的产量，预示本发明提供的重组大肠杆菌在工业化生产中具有很好的应用前景。

主权项

1.一株重组大肠杆菌发酵生产[2Fe2S]铁氧还蛋白的方法，步骤是：(1)构建高效表达[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌，将重组大肠杆菌菌株以体积比1～5％的接种量接种到含有抗生素和铁硫源的TB培养基中培养，获得菌液；其中，上述TB培养基的配方及组分终浓度是：Tryptone 12g/L，Yeast extract 24g/L，Glycerol 4ml/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 12.5g/L；上述抗生素分别是终浓度为25μg/ml的氯霉素，终浓度为10μg/ml的四环素，终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素；(2)向制得的菌液中加入终浓度为0.5mM的IPTG，在35～37℃和180rpm转速下诱导10～24小时，收集培养液离心，获得含[2Fe2S]铁氧还蛋白的重组大肠杆菌细胞；(3)破碎细胞，分离纯化制备[2Fe2S]铁氧还蛋白；其特征在于：上述重组大肠杆菌菌株的构建方法是将来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)S33的[2Fe2S]铁氧还蛋白基因连接入pETDuet‑1载体，制得重组质粒命名为pETDuet‑[2Fe2S]，并将制得的重组质粒转入含有pCodonPlus和pRKISC质粒的E.coli C41(DE3)中获得；该重组大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet‑S33[2Fe2S]Fd，其含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的[2Fe2S]铁氧还蛋白基因；上述重组大肠杆菌菌株是在37±1℃和180±10rpm转速条件下培养2～3小时至OD_620nm为0.4～0.6，获得菌液；上述铁硫源配方及组分终浓度是：柠檬酸铁铵0.2‑0.3g/L，L‑半胱氨酸0.1‑0.2g/L，柠檬酸铁0.18‑0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.25‑0.4g/L。