[发明专利]一种改良简化的植物染色体荧光原位杂交方法

摘要

本发明提供了一种改良简化的植物染色体荧光原位杂交方法。由于该方法不包括杂交前对标本玻片的长时间脱水过程和杂交后对标本制片的多次漂洗流程，因此是一种对生物细胞样品中的核内染色体进行快速原位杂交的技术。所述方法主要涉及：1）通过变温催芽、8‑羟基喹啉预处理和卡诺固定液固定植物根尖分生区细胞分裂旺盛的组织，获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本；2)不同标记荧光探针混合后，一次变性完并低温保存，可实现长期多次使用；3)标本制片采用NaOH醇溶液变性；4）杂交反应过程中，通过简化多步脱水、漂洗等操作步骤，从而极大地精简了整个繁琐的杂交流程。尤其是，所述方法特别适用于快速大规模检测和分析植物远缘及近缘杂交种中的外源染色体和染色体片段，同时很好地保持了标本染色体形态和结构的真实性。

主权项

1.一种改良简化的植物染色体荧光原位杂交方法，其特征在于：由以下步骤组成：1)根尖培养，将植物种子置于底层铺有湿润滤纸的培养皿中，在23℃黑暗培养箱中催芽，待种子露白后，连同培养皿一起转移至4℃冰箱，放置1‑3天；然后继续转移到23℃黑暗培养箱中继续催芽，至根系长2‑3cm；2)标本制作，a.取材：剪取1)中发芽种子的1cm根尖，迅速投放到盛有1×10^‑6M8‑羟基喹啉的小瓶中，在0℃的冰箱中放置14‑20h；b.固定：将根系转移到盛有卡诺固定液的离心管中，在30℃下固定2～3天；c.染色：用醋酸洋红染色根系15‑20分钟；d.制片：用解剖针或解剖刀片切取带有分生区的根尖组织，放在载玻片上，滴加一滴45％醋酸溶液，加盖盖玻片，然后用拇指轻压或用竹签轻敲使细胞分散良好；e.镜检：装片于显微镜，观察细胞内染色体分布情况，并将分散良好的标本玻片保存于‑70℃冰柜；3)探针标记，提取植物基因组DNA，利用随机引物法标记基因组的荧光探针，以及利用PCR法标记DNA片段荧光探针；将基因组的荧光标记探针和DNA片段荧光探针以5:1的体积比与杂交液混合，在沸水浴中变性8‑10分钟，立即置于‑20℃的酒精缸中20分钟以上，后将变性探针杂交液保存于‑4℃；4)荧光原位杂交，a.脱色：从‑70℃冰柜中取出标本玻片，用刀片撬除盖玻片，置于42‑45℃的45％醋酸中脱色2‑3分钟，用洗耳球吹干或空气晾干；b.变性：将风干的标本玻片浸于0.15当量含70％乙醇的NaOH醇溶液中，变性5分钟；c.脱水：将变性后玻片依次通过70％、70％、99％乙醇中分别脱水5分钟，然后立即吹干；d.杂交：向吹干的标本玻片目标区域滴加10‑15μL变性探针杂交液，加盖盖玻片；将标本玻片放入保湿的杂交盒中，然后置于30℃培养箱杂交6h；e.漂洗：将杂交后的标本玻片移掉盖玻片后浸入2×SSC溶液中，漂洗5分钟，拿出玻片迅速用蒸馏水冲洗2‑3次，立即吹干；f.抗体反应：向吹干标本玻片滴加10‑15μL抗体，加盖盖玻片，放入保湿杂交盒中，置于30℃培养箱反应1h；g.复染：取出抗体反应后的标本玻片并移掉盖玻片，用蒸馏水冲洗2‑3次，立即吹干，滴加10‑15μL DAPI染色液，加盖盖玻片，室温染色5分钟以上；5)镜检；其中，所述植物为黑麦或小麦。