[发明专利]用于从单一植物样品中分离DNA、RNA和蛋白质的方法

摘要

本发明提供了一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法，包括步骤：提取液的制备：按照水饱和苯酚：异硫氰酸胍2:1的比例配置成混合液，其后按照2％体积比加入吐温20，加入50mM三羟甲基氨基甲烷,形成混合液；组织样品的粉碎；组织样品的裂解；RNA、蛋白质、DNA样品的制备。本发明对TRIzol试剂中有效成分进行了改良，选取了非离子表明活性剂TWEEN‑20替换阴离子表明活性剂十二烷基肌氨酸钠，十二烷基肌氨酸钠为阴离子表明活性剂与蛋白质结合会对蛋白质的带电荷产出影响，TWEEN‑20与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。

主权项

1.一种用于从单一植物样品中提取和纯化基因组DNA、总RNA和蛋白质的方法，所述方法包括步骤：①.提取液的制备：按照水饱和苯酚:异硫氰酸胍＝2:1(V/W)的比例配置成混合液，其后按照2％体积比加入吐温20，加入50mM三羟甲基氨基甲烷，使用HCl调节pH7，形成混合液A；②.组织样品的粉碎取植物组织样品0.5g，放入灭菌并预冷的研钵中，并加入约50mgPVPP混合，液氮研磨成细粉，将粉末转入离心管；③.组织样品的裂解向离心管中加入5ml混合液A，上下混匀10‑15s，室温放置5min；按0.2ml氯仿/ml混合液A加入氯仿，其后加入2％(w/v)DTT，轻微振荡10‑15s，室温放置3‑4min；在4℃， 8000×g条件下离心15min；离心后混合物分为三层，移取上层水相a至新离心管，用于后续RNA制备；取下层酚相b至 另外一个离心管，用于蛋白质提取；剩余部分c用于DNA制备；④.RNA样品制备取所述水相a到新离心管，按照0.5ml异丙醇/ml混合液a加入异丙醇，混匀，室温放置 5‑10min；在4℃，12000×g条件下离心10min，弃上清；加入1ml75％乙醇，经DEPC处理悬浮沉淀，4℃,8000×g条件下离心5min，去上清；室温晾干沉淀，加入适量DEPC处理水溶解RNA，‑80℃冰箱保存；⑤.蛋白质样品制备取所述酚相b到新离心管，按1.5ml异丙醇/ml混合液a加入下层酚相，4℃孵育20min, 每5‑10min震荡混匀10‑20s；4℃，10000×g条件下离心10min；去上清，按2ml洗液/ml Trizol加入蛋白质沉淀物，所述洗液按照0.3摩尔的盐酸胍溶于在1L的95％乙醇比例配置，室温孵育15‑20min；4℃，20000×g条件下离心5min，重复2次；最后一次沉淀后，用1ml 无水乙醇代替洗液洗涤蛋白；沉淀真空冻干燥，干粉保存于‑80℃备用；⑥.DNA样品制备在剩余部分c加入65℃的CTAB提取液900μL，65℃水浴15至20min；冷却后加入500μL氯仿和异戊醇，所述氯仿：异戊醇＝24：1(V/V)，室温，10000×g条件下离心10min；取上 清液，加入1/10体积的3M醋酸钠和等体积的异丙醇，摇匀至出现絮状沉淀；室温，10000×g条件下离心5min，倒掉上清液；用75％酒精清洗，室温干燥1h后溶于TE缓冲液。