[发明专利]一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法

摘要

一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，属于化学药物杂质研究技术领域。PQQ是多种氧化还原酶的辅基，对酒精性脂肪肝的预防和治疗具有显著作用，有望成为新型的肝损伤防治药物，具有良好的临床应用前景。针对药品中的杂质，必须依据其生理活性制定其质控限度，其中包括药品中的杂质被有效的分离，从而保证药品质量，减少药物的不良反应。杂质的分离制备是药物研究中最为关键的技术之一。本发明将PQQ合成副产物杂质有效分离，制备获得100mg的杂质产物，并采用高分辨质谱（HRMS）、红外吸收光谱（IR）、核磁共振谱（NMR）对杂质的化学结构式进行确证，最终确证其分子式及化学结构和化学名称，为申报PQQ临床用药制定杂质限量提供可靠依据。

主权项

一种吡咯并喹啉醌PQQ二钠盐杂质的分离纯化方法，其特征在于步骤为：（1）PQQ溶解性的考察：在含10%四丁基氢氧化铵的0.04M、pH 7.0磷酸二氢铵缓冲溶液作溶剂时PQQ溶解度达到10mg/mL，满足制备HPLC上样的要求；（2）优化制备分离条件选择四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，选用0.04M磷酸二氢铵作缓冲体系；色谱柱的选择：选择GP C18型号的色谱柱；流动相配比的优化：流动相A： Buffer的配制：称取12.974g的10%四丁基氢氧化铵水溶液，4.6g磷酸二氢铵，加水至1L，用磷酸调至pH 7.0；用0.45μm滤膜过滤；流动相B：乙腈ACN；流动相A /流动相B 的体积比为80/20~70/30之间主峰与杂质分离较好，而且杂质峰对称性较好；pH值的影响：选择pH 7.0；（3）制备柱上的分离上样液的配制：以流动相A为溶解溶液，配制10mg/mL的PQQ溶液，0.45μm滤膜过滤；选择柱子：GP C18：5μm，21.2×250 mm；流动相采用：Buffer︰ACN = 80～70︰20～30，v/v；柱温：室温；流速：20 mL/min；进样体积：10mL；压力：1756 psi；检测波长：225 nm；（4）收集的杂质纯度鉴定a、收集液的处理浓缩：将制备柱得到的收集液在60℃下旋转浓缩5倍，得浓缩液；盐析：在浓缩液中加入1.5M的氯化钠溶液，使收集的馏分溶液中最终的氯化钠浓度达到0.8‑1.0M，用HCl调至pH 2.0；将上述溶液在4℃下静置48h；过滤：用0.45μm滤膜过滤盐析液，将沉淀滤出，再次用去离子水洗涤沉淀2次；干燥：将带沉淀的滤膜置于40℃下真空干燥24h；将样品从滤膜上刮下，置于样品瓶中，称重；包装；b、样品纯度鉴定分析柱：GP C18：5μm，4.6×250 mm流动相：Buffer︰ACN体积比70︰30；柱温：室温；流速: 1 mL/min；进样体积：20μL；检测波长：225 nm；分析过程中出峰时间略有漂移，采用内标法确认了所制备产物为目标杂质，所制备产物的纯度大于95%；（5）杂质结构鉴定所收集的杂质组分采用质谱MS/高分辨质谱HRMS、红外吸收光谱IR、核磁共振谱NMR对PQQ杂质进行分析，最后确证其分子式及化学结构和化学名称，即本杂质的分子式为C14H3N2O8ClNa2，化学名称为3‑氯‑1H‑吡咯[2,3‑f]喹啉‑2,7,9‑三羧酸‑二钠盐。