[发明专利]检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用

摘要

本发明公开了一种检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用，其正义引物Psm240F序列为：5'‑AAGGTAACGGGGCTAAT‑3'，反义引物Psm434R序列为：5'‑GCTGTTGACCGATGATAT‑3'。本发明基于桑丁香假单胞菌区别于其他丁香假单胞菌致病变种的特异性致病基因片段(hrpZ gene)设计和筛选了一对特异性引物对Psm240F/Psm434R，同时利用该引物对建立一种桑丁香假单胞菌的荧光定量PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高的特点，且大大缩短了检测所需时间，从样品处理至得出结果只需4～5h。因此该方法适用于桑疫病的早期诊断。

主权项

1.检测桑丁香假单胞菌的引物在荧光定量PCR检测中的应用，其特征在于包括以下步骤：1）利用KB液体培养基培养病原菌，制备病原菌菌悬液，同时采用Biospin细菌全基因组DNA提取试剂盒提取病原菌总DNA，制备菌液和DNA标准样品；2）特异性引物设计，对致病性的桑丁香假单胞菌设计了其特异性的引物对Psm240F/Psm434R，所述引物对为：正义引物Psm240F序列为：5'‑AAGGTAACGGGGCTAAT‑3'，反义引物Psm434R序列为：5'‑GCTGTTGACCGATGATAT‑3'；3）实时荧光定量PCR检测方法反应体系为：20 μL反应体系中，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)，0.8 μL Psm240F 10 µM ，0.8 μL Psm434R 10 µM ，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，2.0 μL模板为标准病原菌菌悬液和DNA稀释液或待测样品的菌悬液，6 μL双蒸水；4）实时荧光定量PCR检测方法扩增程序为：两步法扩增程序：第一步：95 ℃预变性10 min；第二步：95 ℃变性15 s，60 ℃延伸31 s，反应共计45个循环，PCR完成后，按0.1 ℃/s升温速率从72 ℃升至95 ℃进行融解曲线的分析验证；5）取步骤1）中得到的病原菌菌悬液经平板计数法定量并进行梯度稀释，稀释成9个不同的浓度梯度：1 × 108 cfu/mL，5 × 107 cfu/mL，1 × 107 cfu/mL，5 × 106 cfu/mL，1 × 106 cfu/mL，1 × 105 cfu/mL，1 × 104 cfu/mL，1 × 103 cfu/mL，1 × 102 cfu/mL，同时，取步骤1）中病原菌的全基因组DNA经ND‑1000 V3.7.1定量并10倍梯度稀释，稀释成6个不同的浓度梯度：6.0 ng/μL，6.0 × 10‑1 ng/μL，6.0 × 10‑2 ng/μL，6.0 × 10‑3 ng/μL，6.0 × 10‑4 ng/μL，6.0 × 10‑5 ng/μL，以不同浓度梯度的菌悬液和DNA为模板按照上述PCR反应体系和扩增程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值（Ct）采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。