[发明专利]一种利用短链引物阻遏提高DNA克隆及组装效率的方法

摘要

本发明公开了一种利用短链引物阻遏提高DNA克隆及组装效率的方法。本发明的方法是在原载体上设计两段DNA序列，将目标DNA片段与载体骨架序列隔开，两段DNA序列两侧分别设计有限制性内切酶位点，在进行DNA片段组装时，通过酶切，原载体会分为四部分，随后加入短链引物，短链引物会与原载体上添加的DNA序列中的一条链互补配对，经过该阻遏过程后，由于目的DNA片段的粘性末端与载体不匹配，被切下的目的DNA片段无法被连回原载体，有效的防止了酶切的DNA片段与原载体的自连的过程，因此提高了组装的效率。本发明的方法可以有效的减少克隆步骤、提高克隆效率以及DNA片段的组装效率等。

主权项

1.一种阻遏环状质粒中的目的片段和骨架载体酶切后重新连接的方法，包括如下步骤：1）在环状质粒的目的片段两侧添加DNA片段甲和DNA片段乙，得到环状重组载体，所述环状重组载体从上游起依次包括所述DNA片段甲、所述目的片段、所述DNA片段乙和所述骨架载体；所述DNA片段甲的两端分别为限制性内切酶A的识别切割序列和限制性内切酶B的识别切割序列，所述DNA片段乙的两端分别为限制性内切酶C的识别切割序列和限制性内切酶D的识别切割序列；用所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B、所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D酶切所述环状重组载体后形成的黏性末端依次记作：骨架载体黏性末端1、DNA片段甲上游黏性末端、DNA片段甲下游黏性末端、目的片段上游黏性末端、目的片段下游黏性末端、DNA片段乙上游黏性末端、DNA片段乙下游黏性末端、骨架载体黏性末端2；所述黏性末端满足如下条件：所述目的片段上游黏性末端与所述骨架载体黏性末端1和所述骨架载体黏性末端2均不匹配，所述目的片段下游黏性末端与所述骨架载体黏性末端1和所述骨架载体黏性末端2均不匹配，所述目的片段上游黏性末端与所述目的片段下游黏性末端不同且不匹配；2）用所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B、所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D酶切所述环状重组载体，得到酶切产物；3）将所述酶切产物、短链引物A和短链引物B退火，即实现了阻遏所述目的片段和所述骨架载体酶切后重新连接；所述短链引物A与所述DNA片段甲互补配对，以阻遏所述目的片段和所述骨架载体酶切后重新连接；所述短链引物B与所述DNA片段乙互补配对，以阻遏所述目的片段和所述骨架载体酶切后重新连接。