[发明专利]促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用

摘要

本发明公开了促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌的多因子载体exosome的制备及应用，经过原培养基培养、无血清培养基培养、离心浓缩、添加Exoquick-TC试剂、孵育过夜、离心、重悬、过滤，制得多因子载体exosome。本发明制备的exosome与脂肪干细胞无关，无任何细胞成分，便于运输和储存；应用离心结合试剂提取的方法得到的exosome产量更高，纯度更好，可以在冰箱中长期保存，可以作为细胞治疗的有效替代品，具有极佳的临床应用价值。

主权项

促进皮肤创伤愈合的脂肪干细胞分泌多因子载体exosome的制备方法，其特征在于，该方法包括：步骤一、取处于对数生长期的第三代到第六代的人脂肪干细胞，待细胞融合至80％后，弃去原培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗2‑3遍后，换无血清培养液培养，24h后收集培养上清液；步骤二、将步骤一中收集的上清液，在温度4℃、离心力3000g下离心15分钟，离心去除细胞碎片和悬浮细胞，离心后的上清液经0.22um孔径的无菌滤膜过滤得到脂肪干细胞条件培养液；步骤三、将步骤二中的条件培养液放入分子量为100KDa超滤离心管中，在温度4℃、离心力1000g下离心30分钟，离心浓缩，得到含有exosome的浓缩液；步骤四、将步骤三中的浓缩液与Exoquick‑TC试剂按照5:1的体积比混合，震荡混匀后，4℃孵育过夜；步骤五、孵育过夜后的混合液在温度4℃、离心力1500g下离心30分钟，弃去上清液保留沉淀；步骤六、在温度4℃、离心力1500g下对沉淀离心5分钟，吸净残余液体后，用磷酸盐缓冲液重悬，经0.22um孔径的无菌滤膜过滤后‑80℃保存，即得多因子载体exosome。