[发明专利]一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法

摘要

一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法，包括如下步骤：(1)取黑果菝葜幼嫩带芽茎段作为外植体进行消毒；(2)将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导出芽；(3)将无菌芽置于MS基本培养基中，经继代培养后长成健壮植株；(4)将健壮植株置于生根培养基中培养得到完整的带根苗；(5)将完整的带跟苗置于离体保存培养基中进行培养。采用本发明有利于黑果菝葜野生资源的保护和优良性状的保持，为进一步开展该物种遗传育种和资源保护提供了良好的试验材料，具有广泛的应用前景。

主权项

一种黑果菝葜初代诱导及离体保存的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：(1)外植体的消毒：将3～5滴洗洁精滴入装有100ml自来水的烧杯中，取无病虫害黑果菝葜当年生的幼嫩带芽茎段剪切成4cm长的带芽茎段，置于烧杯中搅拌，再用软毛刷擦拭表面污垢，流水冲洗15min，然后在超净工作台内用75v/v％的乙醇消毒15S，无菌水冲洗1次，再用0.1v/v％HgCl₂消毒10min，无菌水浸泡3次，每次约2min，用无菌滤纸吸干外植体表面水分，获得外植体，其中无菌水为经高温高压灭菌的蒸馏水；(2)无菌芽的诱导：将步骤(1)得到的外植体剪切成1～1.5cm的带芽茎段，接种于MS启动培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行暗培养10d开始萌发，发育成不定芽,所述MS启动培养基是以MS为基本培养基，还加入0.5～2.5mg/L的6‑苄基腺嘌呤6‑BA、0～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA和0～2.0mg/L萘乙酸NAA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(3)无菌芽的继代增殖：将步骤(2)中得到的不定芽剪切成1～2cm长的单芽或芽丛接种于MS继代增殖培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下培养30～40d便长出更多的芽丛，所述继代增殖培养基为MS基本培养基，添加0.1～3.0mg/L的噻重氮苯基脲TDZ、0.5～2.5mg/L的6‑苄基腺嘌呤6‑BA、0.1～2.0mg/L的吲哚乙酸IBA，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(4)无菌苗的生根：将步骤(3)中得到的芽丛剪切为单芽置于1/2MS生根培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行生根培养15～20d获得生根苗,所述1/2MS生根培养基是以1/2MS为基本培养基，还加入0～1.0mg/L的萘乙酸NAA、0～1.0mg/L的吲哚丁酸IBA，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；(5)无菌苗的保存：将步骤(4)中得到的生根苗置于离体保存培养基中，在培养温度为25±3℃，光照强度20～30μmol/m²·s，光照时间为12h/d的条件下进行离体保存，所述离体保存培养基是以MS为基本培养基，还加入0.05～0.5mg/L的6‑苄基腺嘌呤6‑BA、0.05～0.1mg/L的萘乙酸NAA、0.5～2.0mg/L的PP333，30g/L蔗糖，5g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8。