[发明专利]一种检测复烤烟品种混杂的方法

摘要

本发明涉及一种检测复烤烟品种混杂的方法。其技术方案是包括以下步骤：（1）复烤烟DNA的提取：（2）引物合成：（3）简单重复序列间多态性‑聚合酶链式反应：用ISSR引物826或者ISSR引物856在待检测的复烤烟中进行ISSR‑PCR；（4）比对标准图谱：将待检测的复烤烟ISSR‑PCR电泳后的成像照片与标准指纹图谱进行条带比对，如果条带能够吻合即为相应的品种之一，如果不能吻合即为混杂品种，检测完毕。有益效果是：为复烤烟的鉴定与检测提供了方法，在其它复烤烟的实验过程中可以直接参考本实验所筛选得到的引物和相应的退火温度直接进行ISSR‑PCR反应，进而得到相应品种的指纹图谱作为后续比对的标准谱带。

主权项

1.一种检测复烤烟品种混杂的方法，其特征是：包括以下步骤：（1）复烤烟DNA的提取：用DNeasy kit试剂盒提取DNA后在1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用分光光度计检测DNA提取纯度及浓度；（2）引物合成：合成ISSR引物826和ISSR引物856，其中，ISSR引物826的引物序列：ACA CAC ACA CAC ACA CC；ISSR引物856的引物序列：ACA CAC ACA CAC ACA CYA，合成后，用ddH2O将引物溶解；（3）简单重复序列间多态性‑聚合酶链式反应，英文缩写为ISSR‑PCR：用ISSR引物826或者ISSR引物856在待检测的复烤烟中进行ISSR‑PCR；（4）比对标准图谱：将待检测的复烤烟ISSR‑PCR电泳后的成像照片与标准指纹图谱进行条带比对，如果条带能够吻合即为相应的品种之一，如果不能吻合即为混杂品种，检测完毕；步骤（1）复烤烟DNA的提取的具体步骤如下：（a）取复烤烟样品用剪刀剪碎后放在研钵里，加入10 mL液氮研磨，期间再加一次10 mL液氮，继续研磨直至粉末状，用离心管取100 mg；（b）在上述离心管中加入400μL缓冲液AP1和4μL RNase A，漩涡并放置在65℃的水浴锅里水浴10 min，水浴的期间漩涡2‑3次；（c）加入130μL缓冲液AP2，混匀，冰浴5 min；（d）将溶解产物于离心机离心20000 g，按照14000 rpm，5 min；（e）转移溶解产物到QIAshredder柱子上，并放在2 mL收集管上，20000 g离心2 min；（f）转移底液到新的离心管内，不要碰到底部的残留物，加1.5倍体积的缓冲液AP3/E并且混匀；（g）转移650μL混合物到DNeasy Mini柱子上，柱子放置在2 mL收集管中，6000 g，8000 rpm，离心1 min；（h）把这个柱子放置在一个新的2 mL的收集管上，加500μL缓冲液AW，6000 g离心1 min，丢弃底液；（i）再加500μL缓冲液AW，20000 g离心2 min；转移柱子到一个新的1.5 mL的离心管上；（j）加100μL缓冲液AE洗脱，室温放置5 min，6000 g离心1 min；所述的1.0%琼脂糖凝胶的制备方法是：称取琼脂糖0.4g，加40 mL 1×TAE缓冲液，微波炉加热2 min至琼脂糖完全融化，稍微冷却，用移液枪取2.0%的核酸染料GoldView混匀，倾倒于含有胶梳的模具中，至琼脂糖胶完全凝固后取下胶梳备用；其中，TAE缓冲液是指：1000 mL中含242 g Tris碱，57.1 mL冰乙酸和100 mL 的 0.5 mol/L乙二胺四乙酸；步骤（1）中用分光光度计检测DNA提取纯度及浓度中：OD260/OD280比值在1.6~1.8之间、OD260/OD230比值大于2即认为DNA纯度较高，可以用于后续实验，根据分光光度计显示浓度，将DNA稀释至50‑100 ng/μL待用；步骤（3）中的简单重复序列间多态性‑聚合酶链式反应包括以下：PCR反应液体系为50 μL，其中包含5μL 10×PCR buffer，5μL dNTPs，0.5μL ISSR引物，0.5μL Taq DNA 聚合酶，1μL 总DNA，不足的体积用ddH2O补足；反应液用矿物油覆盖，在PCR仪上进行扩增；PCR程序为94 ℃预变性3 min，然后进入PCR循环：94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，40个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min；扩增产物在1×TAE缓冲系统下用2.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳分离，电泳电压100 V电泳50min；电泳完毕后在UVP凝胶成像系统上照像并保存；步骤（3）中的2.0%琼脂糖凝胶的制备方法是：称取琼脂糖0.8 g，加40 mL 1×TAE缓冲液，微波炉加热2 min左右至琼脂糖完全融化，稍微冷却，用移液枪取2.0%的核酸染料GoldView混匀，倾倒于含有胶梳的模具中，至琼脂糖胶完全凝固后取下胶梳备用；其中，TAE缓冲液是指1000 mL中含242 g Tris碱，57.1 mL冰乙酸和100 mL 的 0.5 mol/L乙二胺四乙酸。