[发明专利]一种发酵生产丁二酸的方法

摘要

本发明公开了一种发酵生产丁二酸的方法，其步骤包括产酸菌株构建和重组菌株发酵生产丁二酸。构建重组菌株的出发菌株为产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）NJ113（保藏号CGMCC No.1716）。利用该方法生产丁二酸，得到产酸菌株的方法简单方便，发酵方法简单可行，且产酸能力较强，可以大大降低生产成本，提高经济效益。重组菌株在合成培养基中无需外源添加谷氨酸的培养基中生长并高产丁二酸，在以葡萄糖为碳源时，在厌氧血清瓶中的发酵72h，消耗27g/L的葡萄糖产19.53g/L的丁二酸，丁二酸产率达到72.33%。

主权项

1.一种发酵生产丁二酸的方法，其特征在于，所述方法分两步进行，具体如下：第一步重组菌株构建：包括如下步骤：(1)以保藏号CGMCC No.1716的产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)NJ113为出发菌株，通过电转化法制备A.succinogenes感受态菌株；当菌体OD₆₆₀值在0.3‑0.7之间时，在4100r/min转速下离心10min，用272mM的蔗糖缓冲溶液洗涤3次；电转化条件为2.5Kv，25uF，200Ω，在0.2cm电转杯中进行；(2)合成一对5’端带有酶切位点的引物，以E.coli BL21基因组DNA为模板，纯化扩增出的异柠檬酸脱氢酶基因icdh基因后，将表达质粒pLGZ920用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切，连接获得重组质粒pLGZ920–icdh；(3)合成一对5’端带有BamHI酶切位点的同源重组的引物，以E.coli BL21基因组DNA为模板，纯化扩增出柠檬酸合成酶cs基因后，以构建的重组质粒pLGZ920‑icdh用与引物所设计的酶切位点一致的酶单酶切，一步克隆法连接获得的重组质粒pLGZ920‑icdh‑cs；(4)将步骤(3)所述的质粒导入步骤(1)得到的感受态菌株，获得阳性转化子，即为所述重组菌株；第二步重组菌株发酵：将重组菌株在平板中活化，厌氧箱中过夜培养，后转接至厌氧发酵培养基中厌氧发酵。