[发明专利]一种发酵生产混合醇的方法

摘要

本发明公开了一种发酵生产混合醇的方法。本发明通过调控胞内还原性辅因子（NADPH/NADH）供给水平实现异丙醇、丁醇和乙醇的高效联产。由于异丙醇的合成，菌体在产醇期还原力需求增大，尤其是NADPH，造成胞内还原力供给失衡，在进行厌氧发酵时，总醇产量仅3.88g/L，细胞生长较差，最高细胞量OD₆₀₀值达到4.19。通过在发酵培养基中添加2g/L氯化钙，促进NADH向NADPH转化，恢复了细胞生长和混合醇的合成，混合醇产量有较大的提高。通过在发酵培养基中添加10g/L的碳酸钙，不仅改善了发酵培养基的pH同时有利于产醇的进行，加强了异丙醇通路的NADPH供给，提高了混合醇的总产量。利用本发明发酵生产混合醇的方法，能提高混合醇的生产强度及产量。

主权项

1.一种发酵生产混合醇的方法，其特征在于：所述方法分两步进行，具体如下：/n第一步构建重组菌株：选用保藏号为CCTCC NO：M2010011的丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）XY16为出发菌株，将表达载体pIMP1-ptb-sadh导入到出发菌株中，获得表达sadh基因的重组菌株；所述表达载体pIMP1-ptb-sadh的构建方法具体如下：用NdeⅠ单酶切载体pIMP1-ptb，酶切线性化产物经纯化试剂盒纯化后，sadh通过一步克隆连接；将一步克隆连接的重组质粒转化到大肠杆菌（E.coli）DH5a，涂布到含有100ug/ml氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养12-16h，挑取转化子，接到液体含有100ug/ml氨苄霉素LB培养基中，37℃、200rpm培养12h，提取重组质粒，经测序验证获得能够利用ptb启动子表达sadh的载体pIMP1-ptb-sadh；/n所述表达载体pIMP1-ptb-sadh采用电转化方式导入到出发菌株中；所用电转化缓冲液配制采用270mM蔗糖，5mM NaH₂PO₄，缓冲液pH=7.4；电转化条件为2.0kV，电阻200Ω，电容25uF；/n第二步生产混合醇：将重组菌株接入种子培养基中，通入氮气培养，在发酵培养基中加入氯化钙或碳酸钙进行厌氧发酵；/n所述重组菌株厌氧发酵的发酵温度为37℃；发酵时间为72h；所述氯化钙浓度为2g/L；所述碳酸钙浓度为10g/L。/n