[发明专利]一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法

摘要

本发明公开了一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，步骤如下：(1)将玉米种子进行冷等离子体处理；(2)培养玉米种子得无菌苗；(3)利用农杆菌将目的基因导入无菌苗；(4)培养无菌苗，收获目标玉米种。本发明的等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，将等离子体处理技术与转基因技术相结合，综合了两种技术的优势，可以培育出性能更加优异的玉米新品种。本发明具有以下优点：(1)利用冷等离子技术处理种子能够激发种子活力，实现促长、抗逆效果，育成的玉米种子发芽势、发芽率增加，抗逆性增强。(2)将外源目的基因转入玉米中，可成功表达，从而使得玉米具备耐旱、抗倒伏等优异特性，对玉米的产量性状也有相应的增加。

主权项

一种等离子体处理与转基因结合的玉米育种方法，其特征在于：步骤如下：(1)将玉米品种的种子进行冷等离子体处理：将玉米品种的父母本种子置于冷等离子体处理机内，在140W的处理功率下对玉米种子进行18秒的非电离幅射处理，处理以氦气为工作介质，在真空封闭环境中进行；(2)上述处理后的玉米种子，用70％乙醇浸泡30～45s，用无菌水洗1～2次，而后用0.1％的HgCl₂溶液浸泡8～10min，再用无菌水冲洗4～5次，用滤纸吸干表面残留液体后，接种于不含抗生素的MS发芽培养基上，26±1℃暗培养1～2天，待种子萌动后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发；待胚芽伸长止3～4厘米时，剥离胚芽鞘及2～3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥；(3)利用基因重组技术，将目的基因导入空白基础载体构建重组载体；所得重组载体经三亲杂交法将目的基因转移至农杆菌，挑取单菌落，进行PCR鉴定得到目标农杆菌；(4)目标农杆菌的活化与重悬：用无菌牙签从平板上挑取目标农杆菌单菌落接种至20ml附加抗生素的pH为7.0的LB液体培养基上，28℃，180r/min培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；取菌液加至相同培养基上，28℃，180r/min继续培养5～6小时，培养至菌液浓度OD₆₀₀＝0.5～0.6；5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，去上清，用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，再次用液体MS培养基重悬菌体，而后5000r/min,4℃离心5min，收集菌体，用MS培养基重悬菌体后，即可以用于转化，备用；(5)将活化了的农杆菌菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无菌苗浸泡在菌液中，在0.5×10⁵Pa大气压下处理10分钟；浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在改良MS培养基上于黑暗中培养2～3天，培养温度为22～24℃；然后将无菌苗放在散射光下培养2天；将照光培养后的无菌苗移栽到装有灭菌蛭石的营养钵中，然后让植株在自然光照下生长，日温22～28℃，夜温15～21℃，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐；(6)在转化苗长到3～4叶期时，均匀喷洒合适浓度的草甘膦水溶液行筛选，存活植株长到5～6叶期时移栽到田间收获目标玉米种。