[发明专利]一种濒危羊踯躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法

摘要

本发明公开了一种濒危羊踯躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法，利用简化基因组测序技术开发得到11,687对羊踯躅SSR分子标记，从中鉴定获得了16对多态性SSR分子标记，它们能够检测到羊踯躅基因组的SSR位点信息，其有效等位基因数范围为3‑15个，杂合度(He)范围为0.489‑0.908。本发明提供一批可用于群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究的SSR引物，应用这些多态性SSR分子标记能评估分析濒危羊踯躅遗传多样性和遗传结构，为该物种的保护提供科学依据和参考。

主权项

一种濒危羊踯躅多态性SSR分子标记开发与应用的方法，其特征在于，(1)羊踯躅SSR分子标记的获得：利用简化基因组测序技术对濒危羊踯躅(Rhododendron molle G.Don)基因组进行测序，经序列数据过滤、聚类和组装等步骤，得到171.534Mb的基因组序列，包含498,252contigs，测序质量合格，GC分布正常，采用SSR搜索软件对contig序列进行SSR检测搜索，最后从11,961微卫星位点中开发得到11,687SSR分子标记；(2)SSR分子标记的筛选与合成：从11,687SSR分子标记中选取94对SSR进行遗传多样性的筛选鉴定，SSR分子标记初选的条件是2个碱基重复单元的SSR需要有10～15个拷贝的重复，3个碱基重复单元的SSR需要有6～12个拷贝的重复，开发设计好的SSR分子标记引物序列合成；(3)羊踯躅多态性SSR的鉴定：采用不同地理分布的羊踯躅DNA对合成94对SSR引物进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最后从94对SSR引物中获得16对的多态性SSR分子标记，见表1；(4)羊踯躅多态性SSR分子标记的有效性评估：将筛选获得16对多态性SSR标记在2个羊踯躅自然居群，每个居群含21个个体，进行PCR扩增，评估分析了这16对多态性SSR标记能够用于羊踯躅的遗传多样性分析和保护生物学研究，见表1；(5)多态性SSR分子标记应用：运用本研究获得的多态性SSR分子标记在8个羊踯躅自然居群，含193个个体，进行了遗传多样性分析，获得了一些保护羊踯躅的科学依据，即羊踯躅Shannon多样性指数(I)为1.768，基因多样性指数H为0.777，江西省金溪县居群的遗传变异最丰富，而福建政和的遗传多样性水平最低，见表2，PCA分析和UPGMA分析都表明8个自然群体被分为两组，江西永修居群独立为一组，羊踯躅最好以就地保护为主，应优先保护金溪、永修居群，同时增加对政和和京山居群的保护权重。