[发明专利]一种鸡干扰素冻干剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，属于动物疫苗领域。本发明的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，包括无菌采集健康鸡鲜血，于10℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH₄Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去 NH₄Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％鸡血清的Eagle`s MEM混合培养液悬浮，将鸡白细胞数稀释在10×10⁷个/ml～25×10⁷个/ml之间，制得鸡白细胞悬浮液等六个步骤。本发明的一种鸡干扰素冻干剂的制备方法具有制备长效的鸡病毒干扰素制剂，10天注射一次，对鸡病毒性疾病具有良好效果的特点。

主权项

一种鸡干扰素冻干剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，步骤一：无菌采集健康鸡鲜血，于10℃的条件下离心20min，吸取中间层白细胞，用质量分数为0.85％NH₄Cl洗涤两次后离心，收集沉淀白细胞，除去 NH₄Cl，按照白细胞：培养液体积比1:15加入含5％鸡血清的Eagle`s MEM混合培养液悬浮，将鸡白细胞数稀释在10×10⁷个/ml～25×10⁷个/ml之间，制得鸡白细胞悬浮液；步骤二：取一份鸡白细胞悬浮液，加入含100个活性单位的鸡白细胞干扰素，置于37℃水浴摇床搅拌培养36h；步骤三：按照每毫升鸡白细胞悬液50HA NDVⅡ的加入量，在细胞悬液中加入一定量新城疫病毒NDVⅡ，调节pH为7.2，在水浴恒温振荡器37℃旋转培养24h，培养完成后，用6M HCl把培养液的pH调至3.5，在4℃下酸化处理4d，再用质量体积浓度6%的 NaOH溶液把pH调至7.2，离心去除沉淀，取上清液，制得鸡白细胞干扰素粗制液；步骤四：取一份鸡白细胞干扰素粗制液，用NaOH溶液调节pH值到8.5，在冰浴条件下，按照干扰素粗制液：聚乙二醇酯摩尔比1:5向溶液中加入聚乙二醇酯，聚乙二醇酯加入量为五份，升温至4℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至12℃，搅拌反应2h，向溶液中加入五份聚乙二醇酯，升温至25℃，搅拌反应2h，向溶液加入五份聚乙二醇酯，升温至36℃，搅拌反应2h，完全反应后，加入0.75Μ的半胱甘氨酸终止反应，得到聚乙二醇酯修饰的干扰素；步骤五：取一份聚乙二醇酯修饰的干扰素，取适量去离子水作为溶剂，按照聚乙二醇酯修饰的干扰素：烷基丁二酸酯磺酸钠摩尔比1:1向溶液中加入烷基丁二酸酯磺酸钠，用盐酸调节pH为2.6，按照烷基丁二酸酯磺酸钠：α‑氰基丙烯酸丁酯摩尔比1:2.5向溶液中加入α‑氰基丙烯酸丁酯，搅拌10min，再用NaOH调节溶液的pH为5.8，继续搅拌反应，用0.8μm微孔滤膜除去大的纳米球，得纳米球乳状胶体溶液；步骤六：取一份纳米球乳状胶体溶液，完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，按照纳米球乳状胶体：渗透性保护液体积比1:1.5在次声波振荡条件下加入渗透性保护液，继续在次声波条件下振荡30~45s，将溶液置于真空度0.98的环境下，设置温度为‑12℃，冷冻24h后将溶液置于真空度0.98的环境下，投入液氮中，冷冻3h后，将溶液取出置于真空度0.98的环境下，设置温度为‑20℃，按照120Pa/min的速度恢复气压至常压，得到鸡干扰素冻干剂。