[发明专利]一种小鼠胰岛分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种小鼠胰岛分离纯化方法，采用自制的穿刺针由胆总管逆行穿刺并灌注胶原酶Ⅴ消化胰腺，使用一种密度梯度介质离心结合手工挑选的方法分离纯化胰岛。双硫腙染色鉴定胰岛纯度，AO/PI染色鉴定胰岛活力。葡萄糖刺激的胰岛素释放实验检测胰岛功能。采用此法在大规模的提取胰岛时可以很大程度的节省时间，提高穿刺成功率，减少Ficoll400配制的时间及价格。同时，纯化所得胰岛产量、纯度、活力及胰岛功能都相对良好，是一种简单快捷，廉价高效的小鼠胰岛分离方法。

主权项

1.一种小鼠胰岛分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）穿刺针的制备：将胰岛素注射器从15U处剪开，剪刀修整断口处，取出一个枪头，在酒精灯上烧灼该枪头与移液枪相接的一端，然后迅速将该枪头与胰岛素注射器的断口处进行耦合；烧灼另一个枪头，用其溶解物对上述枪头和胰岛素注射器的耦合处进行加固密封；另取一根静脉输液针，将其针头剪去，然后将静脉输液针的一端连接上述已经烧灼耦合的枪头，另一端连接一个注射器，最后将胰岛素注射器自带的针头斜面朝上弯曲60°；（2）小鼠胰岛的分离：将已死亡的小鼠血液充分放尽，喷洒酒精消毒后，行“V”型切口打开腹腔，将空回肠及结肠翻转至小鼠身体右侧，充分暴露胆总管及十二指肠；在十二指肠处结扎胆总管，然后在靠近肝脏肝总管和胆囊管汇合的“V”字型接口处用步骤（1）制得的穿刺针进行穿刺，穿刺成功后用动脉夹夹闭穿刺针尾端胆总管避免胶原酶反流；将预冷的胶原酶Ⅴ灌入胰腺，使其充分膨胀；随后迅速取下灌注好的胰腺，置于含有胶原酶Ⅴ的离心管中，于38℃恒温水浴箱中静止消化17min；消化结束后在多用途旋涡混合器上斡旋3次，每次3秒；随后，在离心管中加满预冷的Hanks平衡盐溶液终止消化；并于低速离心机上1000rpm离心2min，冲洗2次；离心后弃上清，将沉淀组织用预冷的Hanks平衡盐溶液重悬后40目无菌金属筛网过滤，收集过滤后的组织悬液；（3）小鼠胰岛的纯化：将组织悬液再次离心后加入LSM并用滴管充分吹打混悬；将混悬好的组织悬液于2000rpm条件下离心20min，离心结束后胰岛存在于上清当中；将上清转移至离心管，加入预冷的Hanks平衡盐溶液后于1300rpm条件下离心5min，离心结束后胰岛沉于管底；将胰岛加入Hanks平衡盐溶液重悬后置于体式显微镜下进一步手工挑选法进行纯化；最后将纯化的胰岛移入含有完全培养基中进行培养；其中，平均每只小鼠胰腺加入7ml的LSM；所述LSM为配制好并经过过滤的淋巴细胞分离液，100ml的LSM中含有9.4g的泛影葡胺及6.2g的Ficoll，其在20℃下的密度介于1.077‑1.080之间。