[发明专利]血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法

摘要

本发明公开了一种血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法，采用甲醇提取，待样品冻干后进行两步衍生用于气相色谱‑三重四级杆质谱联用仪分析。采用多反应监测模式进行检测，对于低含量的代谢物，优化得到丰度最佳的离子对作为定量离子对，提高灵敏度；而对于高含量的代谢物，优化后选取丰度低的离子对作为定量离子对，以拓宽其线性范围，以实现高、低丰度代谢物的同时分析。本发明的分析方法具有前处理简单、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等优点。

主权项

1.血清样本中葡萄糖能量代谢相关的重要代谢物的分析方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）在血清样本加入含内标的提取溶液，涡旋混匀，然后离心，定量移取上清溶液，并置于冻干机中冷冻干燥；（2）于冻干后的样本中加入甲氧胺溶液，待代谢物溶解并混匀，水浴加热进行肟化反应；再加入N‑甲基‑N‑(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋混匀，水浴加热进行硅烷化反应；待反应结束后，低温高速离心，取上清溶液用于分析；（3）采用气相色谱‑三重四级杆质谱联用的多反应监测模式进行样本分析，对于含量低于或等于100 μg/mL的代谢物，挑选响应较高的候选母离子在不同碰撞能条件下CE=0‑35V进行子离子扫描，选择信噪比最高的离子对作为定量离子对；而对于含量高于100 μg/mL的代谢物，挑选响应较低的候选母离子在不同碰撞能条件下CE=0‑35V进行子离子扫描，选择线性范围宽的离子对作为定量离子对，实现血清中浓度最大相差4个数量级的代谢物的同时检测分析；（4）采用内标法对代谢物进行定量分析；所述含内标的提取溶液中内标浓度分别为：浓度为50‑250 μg/mL的乳酸‑3,3,3‑d₃，浓度为0.1‑2.0 μg/mL的琥珀酸‑2,2,3,3‑d₄，浓度为0.1‑2.0 μg/mL的富马酸‑2,3‑d₂，浓度为1.0‑10 μg/mL的柠檬酸‑2,2,4,4‑d₄，浓度为100‑500 μg/mL的葡萄糖‑¹³C₆,1,2,3,4,5,6,6‑d₇；所述步骤（2）中于冻干样本中加入20‑200 μL甲氧胺溶液，所述甲氧胺溶液以吡啶为溶剂，甲氧胺浓度为20 mg/mL，涡旋30‑120 s，超声1‑15 min，37‑40 ^oC水浴中反应1.5‑2 h；待反应结束，加入16‑160 μL N‑甲基‑N‑(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋10‑30 s，37 ^oC水浴中反应0.5‑1 h；反应完成后，4‑25 ^oC下12000‑14000 rpm离心10‑15 min，取上清溶液用于分析；所述步骤（3）中采用气相色谱‑三重四级杆质谱联用的多反应监测模式进行样本分析；气相色谱条件：HP‑5 MS色谱柱，具体参数为30 m × 0.25 mm × 0.25 μm, Agilent Technologies, USA；柱温采用程序升温，70 ^oC保持1 min，5 ^oC/min升至190 ^oC，15^oC/min升至310 ^oC，后平衡5 min；进样口温度300^oC，进样体积1 μL，分流比1:5；纯度为99.9995%，中国产的氦气作为载气，流速1.2 mL/min，恒流模式；质谱条件：EI源，‑70 eV，传输线和离子源温度分别是280^oC和230^oC，溶剂延迟时间5.5 min；碰撞气为氮气，流速1.5 mL/min；淬灭气为氦气，流速为2.25 mL/min。